IRF4、ELMO1、CLIP4和MSC啟動子甲基化水平在胃癌早期篩查中的應(yīng)用價值分析

譚玉娥 劉鑫

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。在早期發(fā)現(xiàn)胃癌通常是可治愈的，其5年生存率>90%，而晚期胃癌的預(yù)后仍然較差[1]。胃癌篩查是發(fā)現(xiàn)早期胃癌的主要手段，其中內(nèi)鏡檢查，由于具有較高的準(zhǔn)確性，被廣泛應(yīng)用于胃癌的早期診斷；此外放大內(nèi)窺鏡加上窄帶成像(NBI)在早期胃癌的診斷中的應(yīng)用，進(jìn)一步提高了診斷的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性[2]。但內(nèi)鏡檢查需依賴內(nèi)鏡醫(yī)師的觀察技能，具有一定局限性，同時內(nèi)鏡檢查存在5%～19%的假陰性率，也容易發(fā)生胃癌的漏診[3]。目前一些血清生物標(biāo)志物被用于早期胃癌的篩選，例如糖類抗原CA19-9 和癌胚抗原CEA，然而，這些腫瘤標(biāo)志物的敏感度和特異性仍然較低[4,5]。因此，迫切需要鑒定新的生物標(biāo)志物以進(jìn)行更為準(zhǔn)確的胃癌的早期診斷。已有文獻(xiàn)報道指出，一些腫瘤抑制基因的啟動子甲基化過高與胃癌易感性相關(guān)[6]，與胃癌患者的正常組織相比，許多基因在癌變組織中甲基化[7,8]。目前結(jié)合全基因組、表觀基因組和基因特異性DNA甲基化分析其在胃癌早期診斷中的應(yīng)用仍鮮有報道。因此本研究結(jié)合總體、表觀基因組和基因特異性DNA甲基化分析進(jìn)行第一階段生物標(biāo)記物開發(fā)研究，以檢驗基因特異性啟動子甲基化生物標(biāo)記物以及總體DNA甲基化指數(shù)(GDMI)是否能夠在內(nèi)鏡活檢中將胃癌患者與對照組區(qū)別開來，為胃癌早期篩查提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究選取2014至2018年我院358例高風(fēng)險胃癌患者，所有患者接受了內(nèi)鏡診斷和活檢。胃炎對照組的入選標(biāo)準(zhǔn)為患者出現(xiàn)十二指腸胃炎癥狀，入選標(biāo)準(zhǔn)為根據(jù)胃癌的臨床診斷，這2個標(biāo)準(zhǔn)均由病理學(xué)家確定。其中，282例患者的DNA樣本可以進(jìn)行進(jìn)一步分析。將納入研究的參與者隨機(jī)分為3組：發(fā)現(xiàn)組1用于GDMI分析；發(fā)現(xiàn)組2用于表觀全基因組和基因特異性DNA甲基化分析；驗證組用于GDMI和基因特異性啟動子DNA甲基化分析。研究中所有患者獲得知情同意書，且該研究通過本院倫理委員會審批通過。共有282例患者，符合入選標(biāo)準(zhǔn)，納入本研究，平均年齡(62.5±14.8)歲。發(fā)現(xiàn)組和驗證組患者年齡、性別比、臨床表現(xiàn)均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。150例胃炎患者納入對照組，其中男92例，女52例；平均年齡(53.4±12.3)歲；幽門螺桿菌陽性81例，發(fā)生化生34例。見表1。

表1 患者基線臨床特征

1.2 方法

1.2.1 組織樣本和DNA提取:活檢組織從患者的癌變處和對照組的胃竇處獲得，保存于-70℃。胃黏膜組織采用10%甲醛緩沖液固定，石蠟包埋，顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)檢查。使用Sydney系統(tǒng)對蘇木精和伊紅染色的組織切片進(jìn)行評分(Lash，2013年)，采用PAS染色顯示腸化生的活檢。用沃辛星銀染色法鑒別幽門螺桿菌病變。本研究所用腫瘤組織經(jīng)組織病理學(xué)分類為胃腺癌組織。使用qAMP DNA迷你試劑盒(德國QIAGEN)從冷凍組織樣本中提取DNA，保存于-20℃。

1.2.2 總體DNA甲基化分析:使用MDQ1，Imprint?甲基化DNA定量試劑盒(Sigma，美國)，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法測定總體DNA甲基化水平。并使用450 nm(A450)處吸光度讀數(shù)的平均值進(jìn)行計算。每個樣本的GDMI按照以下公式計算：(A450av樣本-A450av空白)/(A450av對照-A450av空白)×100%。

1.2.3 表觀基因組DNA甲基化分析:采用人甲基化450K DNA 微珠芯片陣列進(jìn)行無偏差表觀全基因組DNA甲基化分析。亞硫酸氫鹽外延試劑盒(德國QIAGEN)進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾基因組DNA(2 μg)。將亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA雜交到人甲基化450K DNA微珠芯片陣列，以識別樣本中的不同甲基化區(qū)域(DMRs)。為了驗證這些結(jié)果，我們進(jìn)行了一個無偏差的表觀全基因組DNA甲基化分析，以確定胃癌樣本(n=298)中的DMRs，這些樣本來自TCGA和胃炎對照組(n=23)。用Illuminaio包將數(shù)據(jù)導(dǎo)入R。對于數(shù)據(jù)歸一化，使用minfi包應(yīng)用noob背景減法和染色偏差校正，然后進(jìn)行歸一化和使用minfi中的bump-hunting方法識別病例和對照組間的DMRs。

1.2.4 基因特異性DNA甲基化分析:從表觀全基因組分析得到的DMR列表(P<0.05)中選擇了4個在DMR窗口中變異較大且CPGs數(shù)量最多的基因：interfer調(diào)節(jié)因子4(IRF4)；編碼吞噬和細(xì)胞運(yùn)動蛋白1(ELMO1)；含帽-甘氨酸結(jié)構(gòu)域的連接蛋白家族成員4(CLIP4)；以及編碼肌蛋白(MSC)。根據(jù)前面描述的方法[9]，設(shè)計了引物和探針，用熒光定量甲基化特異性PCR(QMSP)定量這4個基因的啟動子甲基化。

1.2.5 生物標(biāo)志物開發(fā)流程:采用總體DNA甲基化分析法建立總體DNA甲基化指數(shù)(GDMI)。表觀全基因組陣列被用來鑒定癌癥中不同甲基化的基因特異性啟動子區(qū)域，可以用甲基化特異性PCR定量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用Stata13(美國得克薩斯州Statacorp)進(jìn)行分析和管理，采用t檢驗或方差進(jìn)行數(shù)據(jù)對比分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總體DNA甲基化和胃癌

2.1.1 在沒有發(fā)生化生的胃炎患者(平均值=5.69)、發(fā)生化生的胃炎患者(平均值=4.68)和胃癌患者(平均值=3.36)中，總體DNA甲基化與胃癌呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。比較沒有化生的胃炎患者和胃癌患者的總體DNA甲基化(P<0.01)。見圖1。

圖1 非化生胃炎患者、化生胃炎患者和胃腺癌患者中的GDMI結(jié)果

2.1.2 在發(fā)現(xiàn)組(n=60)的隨機(jī)患者中確定了與胃炎相關(guān)的總甲基化≥6.5，以評估高風(fēng)險胃癌臨床中的GDMI。在驗證組(n=135)中使用該標(biāo)準(zhǔn)來確定胃癌病例，敏感性為84.65%，特異性為31.75%，陰性預(yù)測值(NPV)為85.86%，陽性預(yù)測值(PPV)為31.12%(P=0.021)。用同樣的GDMI標(biāo)準(zhǔn)(臨界值)來確定化生 ≥ 10%的病例時，敏感性為86.76%，特異性為35.43%，陰性預(yù)測值(NPV)為95.65%，陽性預(yù)測值(PPV)為15.86%(P=0.089)。當(dāng)GDMI閾值提高至9時，對胃癌病例靈敏度和隱形預(yù)測值可達(dá)到100%。見表2。

表2 GDMI在內(nèi)鏡活檢中對胃炎和胃癌患者檢測結(jié)果 %

2.2 表觀基因組DNA甲基化分析

2.2.1 胃癌和胃炎患者表觀基因組甲基化對比分析:對胃炎患者(n=23)和胃癌患者(n=11)進(jìn)行比較，通過表觀全基因組DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn)了250個具有統(tǒng)計學(xué)意義的DMRs(P<0.05)。DMR主要分布在6號染色體(11%)，其次是1號染色體(10%)、19號染色體(8%)、2號染色體(7%)、7號染色體(6%)和5號染色體(6%)。其他染色體的DMRs均未超過5%。發(fā)現(xiàn)的DRMs主要分布于基因組的以下區(qū)域：基因內(nèi)部215個DMRs(42%)；啟動子區(qū)域91個 DRMs(19%)；重疊區(qū)域83個DMRs(16%)；TSS下游56個DMRs(11%)；TSS上游56個DMRs(11%)。每個DMR的單個CpG數(shù)量在1～18。大部分(98%)DMR的CpG數(shù)低于10。超過10個GpC的DRMs分布于第1外顯子的下游區(qū)域(15 DMRs)、外顯子的內(nèi)部區(qū)域(6 DMRs)、外顯子的覆蓋區(qū)域(3 DMRs)、第1外顯子的上游區(qū)域(2 DMR)、內(nèi)含子的內(nèi)部區(qū)域(1 DMR)和2個外顯子的重疊區(qū)域(1 DMR)中。

2.2.2 在TCGA樣本中使用bump-hunting的表觀基因組DNA甲基化分析:對TCGA樣本中的正常樣本(n=12)和癌癥樣本(n=298)進(jìn)行表觀全基因組DNA甲基化分析，共發(fā)現(xiàn)350個具有統(tǒng)計學(xué)意義的DMRs(P<0.05)。大多數(shù)DMR位于1號染色體(11%)，其次是6號染色體(9%)和2號染色體(8%)。DMRs存在于基因組的以下區(qū)域：在基因內(nèi)部67 DMRs(53%)；啟動子區(qū)域30 DMRs(23%)；重疊5’區(qū)域15DMRs(12%)；TSS下游10 DMRs(7%)；TSS上游6 DMRs(4%)。每個DMR的單個CpG數(shù)量在1～10。大多數(shù)低于4(95%)。超過4個CpG的DMR位于第1個外顯子的下游區(qū)域重疊(9 DMRs)，外顯子內(nèi)(5 DMRs)，內(nèi)含子內(nèi)(3 DMRs)，覆蓋外顯子(1 DMR)。

2.3 與胃癌相關(guān)的DMR基因特異性DNA甲基化和TCGA數(shù)據(jù)集 用定量甲基化特異PCR(quantitative methylation specific PCR，qMSP)確定了135個樣本中及TCGA樣本集共有的具有統(tǒng)計學(xué)意義的DMRs(P<0.05)中有4個啟動子甲基化：IRF4、ELMO1、CLIP4和MSC。在散點(diǎn)圖的X軸上看到的基因組坐標(biāo)幾乎沒有差異，這些散點(diǎn)圖通過對我院患者樣本和TCGA樣本的兩個單獨(dú)的表觀全基因組分析說明ELMO1和MSC具有顯著性。從無化生胃炎到化生胃炎，再到胃腺癌的組織學(xué)進(jìn)程中，IRF4(P<0.01)、ELMO1(P<0.01)、CLIP4(P<0.01)和MSC(P<0.01)的啟動子甲基化與疾病的加重程度密切相關(guān)。這些結(jié)果表明IRF4、ELMO1、CLIP4和MSC的啟動子甲基化可能是胃癌CpG島甲基化表型(CIMP)的一部分。見圖2、3。

圖2 不同樣本DMRs分布結(jié)果

2.4 具有基因特異性甲基化的預(yù)測模型 我們在發(fā)現(xiàn)組(n=87)的數(shù)據(jù)集中使用與胃癌相關(guān)的基因特異性甲基化來估計使用IRF4、ELMO1、CLP4或MSC的單獨(dú)篩選模型來分類驗證集中被確定為具有高胃癌基礎(chǔ)風(fēng)險的參與者。在GDMI < 6.5時，正確分類率達(dá)到73%。見表3。

表3 使用IRF4、ELMO1、CLIP4或MSC預(yù)測GC風(fēng)險的模型的優(yōu)勢比和系數(shù)

2.5 內(nèi)鏡誤診樣本GDMI分析 胃癌患者的總體DNA甲基化水平明顯低于胃炎對照組(P=0.002)。對照組平均GDMI為5.7(95% CI，4.93～6.41)，胃癌患者平均GDMI為3.7(95% CI,2.99～4.39)。深度炎癥與總體DNA低甲基化有關(guān)，這是癌癥的1個標(biāo)志。GDMI能夠根據(jù)炎癥深度識別胃炎患者(P=0.01)。患有淺表炎癥的胃炎患者的平均GDMI為6.52(95% CI，5.4～7.6)，而患有深度炎癥的患者的GDMI為4.75(95%CI，3.84～5.67)。此外，在患有深度炎癥的胃炎患者中，當(dāng)比較有腸化生或無腸化生的患者時，我們發(fā)現(xiàn)GDMI與此有顯著相關(guān)性(P=0.03)。與未發(fā)生腸化生的胃炎患者(平均值=5.4，95% CI，3.88～6.83)相比，患有深度炎癥和腸化生的胃炎患者的總體DNA甲基化水平顯著降低(P=0.03)(平均值=3.6，95%CI，2.65～4.63)。見圖4。

圖3 基因特異性啟動子甲基化在不同組患者中的箱線圖結(jié)果

圖4 不同類型患者GDMI對比結(jié)果

3 討論

本研究結(jié)合胃癌總體DNA、表觀基因組DNA和基因特異性DNA甲基化分析研究內(nèi)鏡活檢后的胃癌高風(fēng)險患者。結(jié)果表明，CLIP4、IRF4、ELMO1和MSC的啟動子甲基化并且GDMI > 4，是內(nèi)鏡活檢中胃癌風(fēng)險分級中有效分子指標(biāo)。

CLIP4是T細(xì)胞泛素配體家族的成員，抑制T細(xì)胞信號傳導(dǎo)，CLIP4可以促進(jìn)T細(xì)胞中生長因子的提取誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)T細(xì)胞受體、表皮生長因子(EGF)受體和血小板衍生生長因子β受體等各種活化的靶受體的積累[10]。有研究表明胃癌中的CLIP4是甲基化的。IRF屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族，在各種基因(如干擾素、白介素、MHC Ⅰ/Ⅱ類)、凋亡和分化/成熟的調(diào)節(jié)中起到重要作用[11]。ELMO1在惡性膠質(zhì)瘤中起到促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用，ELMO1啟動子甲基化作用在人類結(jié)直腸癌、腎病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中也有報道[12]。MSC基因編碼的肌蛋白作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，在體內(nèi)也和E2A蛋白形成異二聚體，抑制E2A蛋白E47在哺乳動物細(xì)胞中的激活能力[13]。

本研究探究了GDMI作為胃癌發(fā)生的生物標(biāo)志物的作用。胃癌活檢中觀察到的低GDMI水平，胃癌上皮發(fā)育不良和黏膜內(nèi)癌組織的LINE-1甲基化水平明顯低于相鄰的正常胃癌組織，與之前研究結(jié)果[14]一致。LINE-1是總體DNA甲基化的一個替代標(biāo)記，它測量基因組中一組重復(fù)元件的甲基化。GDMI比LINE-1更能反映總體DNA甲基化水平，因為它能量化整個人類基因組中的DNA甲基化。本研究進(jìn)一步表明，GDMI可以鑒別不同程度炎癥和化生的胃炎患者。這一有趣的分子差異表明，僅根據(jù)胃黏膜上皮細(xì)胞的總體DNA甲基化水平，就有可能區(qū)分不同程度的胃炎嚴(yán)重程度、腸化生及胃腺癌。

GDMI可以區(qū)分炎癥的深度，因為患有深度炎癥的胃炎患者的GDMI比患有淺表炎癥的患者低，這表明在分子水平上，這些患者可能是胃癌最容易發(fā)展的患者。我們還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對比腸化生<或>10%的患者，腸化生>10%的患者GDMI較低(P=0.013)。對胃炎患者最初被內(nèi)鏡檢查者診斷為癌癥，其GDMI值低于胃炎患者，這類患者被內(nèi)鏡檢查者和病理學(xué)家歸類為胃炎患者。此外，這些胃炎患者誤診為癌癥患者的內(nèi)鏡下有類似的總體DNA甲基化概況腺癌患者。這些數(shù)據(jù)支持這樣一種觀點(diǎn)，即誤診病例具有潛在的致癌分子過程，最有可能惡化為癌癥。

目前只有少數(shù)研究本身檢查了胃癌的總體DNA低甲基化，理由是低甲基化是最早的表觀基因組事件，意味著從正常表型向惡性表型的轉(zhuǎn)變。雖然導(dǎo)致癌癥甲基化模式整體缺失的確切機(jī)制仍有待闡明，但很明顯，在胃癌發(fā)生的早期階段，總體DNA低甲基化已經(jīng)存在，并可能在生物學(xué)上發(fā)揮各種作用。胃癌病變進(jìn)展中，全基因組的低甲基化和區(qū)域高甲基化已經(jīng)被證明發(fā)生在1個擴(kuò)大的折疊胃炎，也可能有助于擴(kuò)散型胃癌的腫瘤發(fā)生[15]。總之，這些研究表明，GDMI可能是胃癌發(fā)生和發(fā)展中重要早期細(xì)胞事件的表觀基因組反映。我們后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步分析與信號通路中過度及欠表達(dá)相關(guān)的特定基因位點(diǎn)的甲基化差異，以及這些基因如何與其他類型的癌癥相匹配，這些都可能成為精確醫(yī)學(xué)時代新的診斷工具。