LINC00339調控miR-195-5p對高糖作用的成骨細胞增殖和凋亡的影響

竇越超 王雪飛

糖尿病性骨質疏松癥(diabetes osteoporosis，DOP)是糖尿病的一種并發癥，是由于血糖升高導致骨組織代謝紊亂而引起的骨組織結構破壞、骨量減少、骨脆性增加、易引發骨折為特征的全身性骨骼疾病，嚴重影響患者生活質量，目前尚無有效藥物治療DOP，亟需開發新的治療藥物和方法[1]。成骨細胞是促進骨形成的主要功能細胞，成骨細胞凋亡是引起骨質疏松的重要原因，研究成骨細胞的凋亡機制對預防和治療骨質疏松癥具有重要意義[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)參與了多種生物學過程，與骨質疏松也密切相關，可作為骨質疏松(osteoporosis，OP)骨代謝過程中的生物標志物，為OP診斷、治療及判斷預后提供新的靶標[3]。有研究報道rs3820282是染色體1p36.12上具有最強子宮內膜異位癥風險關聯的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)，通過細胞分裂周期蛋白42(cell division cycle protein 42，CDC42)和LINC00339的反向調節起作用[4]。染色體1p36.12的骨質疏松癥風險SNP rs6426749-G等位基因可以提高LINC00339的表達，而LINC00339的下調可促進骨代謝關鍵調節因子CDC42的表達，表明LINC00339可能與骨質疏松癥有關[5]。但目前筆者未發現LINC00339對成骨細胞生物行為的影響及其機制還未有研究。研究發現miR-195-5p通過靶向成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，FGF2)抑制子宮內膜癌細胞的增殖、侵襲和遷移并促進細胞凋亡，其可作為子宮內膜癌的治療靶點[6]。上調miR-195-5p通過降低其靶基因骨形態發生蛋白受體-1α(bone morphogenetic protein receptor-1α，Bmpr1α)的表達可降低骨髓間充質干細胞的成脂分化，改善骨質疏松癥狀[7]。本實驗旨在研究LINC00339和miR-195-5p對成骨細胞增殖、凋亡的影響及LINC00339是否通過調控miR-195-5p影響成骨細胞的增殖和凋亡。為骨質疏松的預防和治療提供新思路和新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 成骨細胞hFOB1.19購自上海通派生物科技有限公司；DMEM培養基、胎牛血清購自美國Sigma公司；胰蛋白酶購自美國Gibco公司；Lipofectamine TM 2000轉染試劑盒、RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司；二辛可寧酸(BCA)試劑盒、聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)、十二烷基硫酸鈉，鈉鹽-聚丙烯酰胺凝膠電泳(dodecyl sulfate,sodium salt-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)試劑盒、四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；抗體均購自北京博奧森生物科技有限公司；載體質粒均購自上海斯信生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。Bio-Rad2550型全自動酶標儀、FACSCanto Ⅱ流式細胞儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組:將hFOB1.19細胞在37℃的培養箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養，每隔2～3 d傳代1次，將融和至80%的細胞無血清饑餓培養24 h，用終濃度為22 mmol/L的葡萄糖溶液培養細胞48 h作為高糖組，同時以終濃度為5 mmol/L的葡萄糖溶液處理作為對照組。將pcDNA3.1、pcDNA3.1-LINC00339、si-NC、si-LINC00339分別轉染至正常hFOB1.19細胞中，記為pcDNA3.1組，pcDNA3.1-LINC00339組、si-NC組、si-LINC00339組。將si-NC、si-LINC00339轉染至高糖處理的hFOB 1.19細胞中，記為高糖+si-NC組、高糖+si-LINC00339組；將si-LINC00339與anti-miR-NC、anti-miR-195-5p分別共同轉染至高糖處理的hFOB1.19細胞中，記為高糖+si-LINC00339+anti-miR-NC、高糖組+si-LINC00339+anti-miR-195-5p組；轉染按Lipofectamine TM 2000轉染試劑盒進行。

1.2.2 熒光實時定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測miR-195-5p和LINC00339的表達水平:提取總RNA，將RNA逆轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明進行PCR，miR-195-5p和LINC00339分別以U6和GAPDH為內參，每個樣品設3個重復，循環條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環；60℃延長5 min。相對表達量用2-ΔΔCt法計算。miR-195-5p上游引物序列：5’-GATAGCAGCACAGAAATATTGGC-3’，下游引物序列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6上游引物序列：5’-CTGGTAGGGTGCTCGCTT-3’，下游引物序列：5’-CGGCAGCAACTGGTGTCGTGGA-3’；LINC00339上游引物序列：5’-GGTTGACGAAGTCTGGAACG-3’，下游引物序列：5’-GCCCATCATTTCATTGGGTA-3’；GAPDH上游引物序列：5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’，下游引物序列：5’-CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAG-3’。

1.2.3 蛋白質印跡(Western Blot)檢測細胞周期素D1(CyclinD1)、P21、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、骨形態發生蛋白-2(BMP-2)表達水平:各組細胞培養48 h后提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品用SDS-PAGE電泳轉至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4℃過夜，TBST洗滌3次；加入二抗室溫孵育90 min，TBST洗滌3次，用ECL發光法染色，用ChemiDoc XRS+系統成像，用Quantity One凝膠分析軟件處理，檢測蛋白條帶的灰度值，蛋白相對表達水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。每個蛋白樣品設3個重復。

1.2.4 MTT檢測細胞活性:各組細胞培養24 h、48 h、72 h時，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，置于37℃培養箱培養4 h；1 000 r/min離心10 min，吸棄培養液，每孔加150 μl的DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。酶標儀上檢測490 nm波長的吸光度(OD)值。細胞活性(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。實驗重復3次，每次設3個復孔。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡:各組細胞培養48 h后用預冷的PBS漂洗2次，與500 μl的結合緩沖液混勻。先加入10 μl的Annexin V-FITC，再加入5 μl的PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.2.6 熒光素酶報告基因檢測實驗檢測LINC00339對miR-195-5p的靶向調控:構建LINC00339野生型和突變型3′UTR熒光素酶表達載體WT-LINC00339和MUT-LINC00339，用LipofectamineTM 2000將WT-LINC00339和MUT-LINC00339分別與miR-NC和miR-195-5p共轉染至轉染hFOB1.19細胞中。按照說明書操作檢測熒光活性，實驗重復3次。

2 結果

2.1 LINC00339、miR-195-5p在高糖作用的細胞hFOB1.19中的表達 與對照組比較，高糖組細胞hFOB1.19中LINC00339表達水平顯著升高，miR-195-5p表達水平顯著降低(P<0.05)。在高糖作用的細胞hFOB1.19中LINC00339高表達，miR-195-5p低表達。見表1。

表1 LINC00339、miR-195-5p在高糖作用的細胞hFOB1.19中的表達

2.2 抑制LINC00339對高糖作用的細胞hFOB1.19增殖的影響 與高糖+si-NC組比較，高糖+si-LINC00339組細胞hFOB1.19中LINC00339表達水平顯著降低，Cyclin D1表達水平顯著升高，P21表達水平顯著降低，細胞活性顯著升高(P<0.05)。抑制LINC00339表達促進高糖作用的細胞hFOB1.19增殖。見圖1，表2。

圖1 抑制LINC00339對高糖作用的細胞hFOB1.19增殖蛋白表達的影響；1 高糖+si-NC，2 高糖+si-LINC00339

表2 抑制LINC00339對高糖作用的細胞hFOB1.19增殖的影響

2.3 抑制LINC00339對高糖作用的細胞hFOB1.19凋亡及BMP-2的表達的影響 與高糖+si-NC組比較，高糖+si-LINC00339組細胞hFOB1.19中BMP-2、Bcl-2表達水平顯著升高，Bax表達水平顯著降低，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。抑制LINC00339抑制高糖作用的細胞hFOB1.19凋亡及促進BMP-2表達。見圖2，表2。

圖2 抑制LINC00339對高糖作用的細胞hFOB1.19凋亡及BMP-2的表達的影響；A 抑制LINC00339對高糖作用的細胞hFOB1.19凋亡的影響;B 抑制LINC00339對高糖作用的細胞hFOB1.19凋亡蛋白及BMP-2表達的影響

表3 抑制LINC00339對高糖作用的細胞hFOB1.19凋亡及BMP-2的表達的影響

2.4 LINC00339靶向、調控miR-195-5p TargetScan數據庫預測顯示LINC00339與miR-195-5p有結合位點。轉染野生型和突變型表達載體WT-LINC00339和MUT-LINC00339后，與miR-NC組比較，miR-195-5p組轉染野生型細胞hFOB1.19的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉染突變型細胞hFOB1.19的熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)。與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-LINC00339組miR-195-5p表達水平顯著降低；與si-NC組比較，si-LINC00339組miR-195-5p表達水平顯著升高(P<0.05)。LINC00339可靶向調控miR-195-5p。見圖3，表4、5。

圖3 LINC00339靶向miR-195-5p

表4 熒光素酶報告實驗

2.5 抑制miR-195-5p能逆轉抑制LINC00339對高糖作用的細胞hFOB1.19增殖的影響 與高糖+si-NC組比較，高糖+si-LINC00339組細胞hFOB1.19中miR-195-5p表達水平顯著升高，Cyclin D1表達水平顯著升高，P21表達水平顯著降低，細胞活性顯著升高(P<0.05)；與高糖+si-LINC00339+anti-miR-NC組比較，高糖+si-LINC00339+anti-miR-195-5p組細胞hFOB1.19中miR-195-5p表達水平顯著降低，Cyclin D1表達水平顯著降低，P21表達水平顯著升高，細胞活性顯著降低(P<0.05)。抑制miR-195-5p能逆轉抑制LINC00339對高糖作用的細胞hFOB1.19增殖的促進作用。見圖4，表6。

表5 LINC00339調控miR-195-5p的表達

表6 抑制miR-195-5p能逆轉抑制LINC00339對高糖作用的細胞hFOB1.19增殖的影響

圖4 抑制miR-195-5p能逆轉抑制LINC00339對高糖作用的細胞hFOB1.19增殖蛋白表達的影響；1 高糖+si-NC；2 高糖+si-LINC00339；3 高糖+si-LINC00339+anti-miR-NC；4 高糖+si-LINC00339+anti-miR-195-5p

2.6 抑制miR-195-5p能逆轉抑制LINC00339對高糖作用的細胞hFOB1.19凋亡的影響 與高糖+si-NC組比較，高糖+si-LINC00339組細胞hFOB1.19中BMP-2、Bcl-2表達水平顯著升高，Bax表達水平顯著降低，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與高糖+si-LINC00339+anti-miR-NC組比較，高糖+si-LINC00339+anti-miR-195-5p組細胞hFOB1.19中BMP-2、Bcl-2表達水平顯著降低，Bax表達水平顯著升高，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。抑制miR-195-5p能逆轉抑制LINC00339對高糖作用的細胞hFOB1.19凋亡的抑制作用。見表7，圖5。

表7 抑制miR-195-5p能逆轉抑制LINC00339對高糖作用的細胞hFOB1.19凋亡及BMP-2表達的影響

圖5 抑制miR-195-5p能逆轉抑制LINC00339對高糖作用的細胞hFOB1.19凋亡蛋白及BMP-2表達的影響；1 高糖+si-NC；2 高糖+si-LINC00339；3 高糖+si-LINC00339+anti-miR-NC；4 高糖+si-LINC00339+anti-miR-195-5p

3 討論

DOP以高血糖和骨密度減低為特點，近些年來，DOP發病率升高，且易致病理性骨折、致殘率高，深入研究其發病機制，控制血糖和OP相關危險因素，有利于防治DOP[8]。有研究表明高糖高脂可抑制成骨細胞分化能力[9]；高糖高脂還可時間依賴性抑制成骨細胞增殖，促進凋亡[10]。本實驗結果顯示，在高糖作用的成骨細胞hFOB1.19中LINC00339表達水平顯著升高，miR-195-5p表達水平顯著降低。提示，LINC00339和miR-195-5p可能參與成骨細胞的增殖、分化和凋亡等生物學過程。

有研究報道LINC00339在非小細胞肺癌組織和細胞中顯著上調，LINC00339沉默通過靶向miR-145調控FOXM1在體外和體內抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和侵襲，加速細胞凋亡，抑制腫瘤生長[11]。LINC00339在膠質瘤組織以及膠質瘤細胞系中也上調表達，敲除LINC00339抑制膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲和管形成[12]。LINC00339通過miR-1182/SKA1途徑促進肝細胞癌的生長和侵襲[13]；LINC00339過表達通過miR-377-3p促進三陰性乳腺癌增殖，抑制細胞周期停滯和抑制細胞凋亡[14]。本實驗結果顯示，在高糖處理的成骨細胞hFOB1.19中轉染si-LINC00339后，細胞活性顯著升高，細胞凋亡率顯著降低。且細胞周期素D1(CyclinD1)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)表達水平顯著升高，P21、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 assiociated X protein，Bax)表達水平顯著降低；抑制LINC00339表達，骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)表達水平顯著升高，而BMP-2可在體內和體外促進間充質干細胞向成骨細胞分化[15]。說明抑制LINC00339表達促進了成骨細胞增殖，抑制了高糖作用的成骨細胞凋亡。

有研究報道miR-195通過靶向SMAD7可促進人骨髓間充質干細胞成骨分化[16]。miR-195-5p高表達可以抑制膀胱癌細胞增殖、促進細胞凋亡[17]。lncRNA XIST通過miR-195-5p靶向YAP促進骨肉瘤細胞增殖和侵襲[18]。本實驗結果顯示，LINC00339靶向調控miR-195-5p，在高糖作用的成骨細胞中，同時抑制miR-195-5p和LINC00339的表達，Cyclin D1、Bcl-2、BMP-2表達水平顯著降低，P21、Bax表達水平顯著升高，細胞活性顯著降低，細胞凋亡率顯著升高。即抑制miR-195-5p逆轉了抑制LINC00339對高糖作用的成骨細胞增殖促進和凋亡抑制的作用。說明LINC00339可能通過調控miR-195-5p影響成骨細胞的增殖和凋亡。

綜上所述，抑制LINC00339可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，對高糖作用的成骨細胞有保護作用，其機制可能與miR-195-5p表達水平有關。將可為骨質疏松癥的預防和治療提供新策略和新思路。