miR-582-5p通過靶向SOCS1基因調節(jié)皮膚黑色素瘤細胞遷移、侵襲和EMT的機制研究

李靜 劉琴 柯錦

人類黑色素瘤是皮膚腫瘤中常見的惡性腫瘤，據統(tǒng)計，2018年，全球皮膚黑色素瘤新增病例為287 723例，死亡病例達60 712例[1]。黑色素瘤具有高度侵襲性，近1/3的黑色素瘤患者將經歷疾病復發(fā)，大多數復發(fā)最終發(fā)展為轉移性疾病[2]。然而，黑色素瘤的生長和轉移機制仍不清楚。因此，需要進一步的研究來闡明黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機制，以開發(fā)有希望的治療方法。微小RNA(microRNA，miRNA/miR)是一類內源性非編碼RNA，在組織和細胞中特異性表達。迄今為止，已經確定了多個在黑色素瘤細胞增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮關鍵作用的miRNA，以及參與細胞凋亡、免疫應答、上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的miRNA[3,4]，如miR-150-5p[5]、miR-27a[6]、miR-1297[7]、miR-22[8]，miRNA可能是黑色素瘤的有效治療靶點。既往研究表明，微小RNA-582-5p(microRNA-582-5p，miR-582-5p)在人子宮內膜癌組織中的表達顯著降低，miR-582-5p的上調抑制子宮內膜癌細胞增殖，促進細胞凋亡[9]。miR-582-5p通過靶向調控絲氨酸/蘇氨酸激酶3(serine/threonine kinase 3，AKT3)抑制胃癌細胞增殖，誘導其凋亡[10]。上調miR-582-5p抑制人結腸癌細胞增殖、細胞周期進展和侵襲[11]。但miR-582-5p在黑色素瘤細胞中的生物學功能尚未明確。MiR-29a通過調節(jié)腫瘤抑制因子細胞因子信號轉導抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)的甲基化來抑制宮頸癌的侵襲和轉移[12]，SOCS1基因沉默抑制人惡性黑色素瘤細胞和人胰腺癌細胞增殖[13,14]。基于此，本研究在體外培養(yǎng)黑色素瘤細胞，觀察miR-582-5p對細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡、EMT的影響及對SOCS1的靶向關系，以探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人黑色素瘤細胞株(A375、G361、WM35、M14)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)，人類皮膚黑色素細胞(NHEM)、Melanocyte Growth Medium培養(yǎng)基購自瑞士LONZA公司，RPMI-1640培養(yǎng)基(Roswell Park Memorial Institute)購自美國Gibco公司，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒、實時定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司，miR-582-5p、anti-miR-582-5p、pcDNA-SOCS1購自武漢淼靈生物科技有限公司，SOCS1、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、β肌動蛋白(β-actin)購自美國Cell Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶標記二抗購自Abcam公司，異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide,Annexin Ⅴ-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司，Matrigel基質膠購自美國BD公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 細胞A375、G361、WM35、M14培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，NHEM細胞培養(yǎng)于Melanocyte Growth Medium培養(yǎng)基，均在37℃、5%CO2的飽和濕潤培養(yǎng)箱中生長。

1.3 RNA提取和qPCR反應 為了量化miR-582-5p和SOCS1 mRNA表達，使用TRIzol提取A375、G361、WM35、M14、NHEM細胞總RNA，使用逆轉錄試劑盒將總RNA轉化為cDNA，接下來進行qPCR。U6和β-actin分別用作miR-582-5p和SOCS1 mRNA表達的內參，使用2-ΔΔCt方法定量相對基因表達。引物序列如下：miR-582-5p正向5’-GCGGTTACAGTTGTTCAACC-3’，反向5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；內參U6正向5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，反向5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；SOCS1正向5’-TGCGCCTCAAGACCTTCAG-3’，反向5’-CATCAGGCTCTCGCTTTTGGA-3’；內參β-actin正向5’-GTATCCTGACCCTGAAGTACC-3’，反向5’-TGAAGGTCTCAAACATGATCT-3’。

1.4 細胞轉染 收集處于指數生長期的A375細胞，并在轉染前1 d以1×105個細胞/孔的密度接種到6孔板中。細胞密度達約70%時，根據制造商的方案，將miR-582-5p、anti-miR-582-5p、pcDNA-SOCS1使用Lipofectamine 2000試劑轉染。轉染后48 h，收獲轉染的A375細胞，分別用于后續(xù)檢測。

1.5 蛋白質印跡(Western blot)分析 將細胞用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌2次，并用RIPA裂解液裂解。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)(10%凝膠)分離等量的總蛋白質(20 μg)，然后轉移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。用5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h后，將膜在4℃下與SOCS1、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin一抗孵育過夜。用含有Tris緩沖鹽的Tween-20溶液(tris buffered saline with Tween-20，TBST)充分洗滌后，在室溫下加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h。最后，使用增強的化學發(fā)光液使免疫反應蛋白可視化。β-actin用作內參蛋白。

1.6 細胞增殖檢測 使用噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)評估A375細胞增殖的影響。收集轉染的A375細胞，并將1×105個/ml密度的細胞接種到96孔板中。在37℃，5%CO2下孵育24、48、72 h后，通過向每孔細胞中加入20 μl MTT溶液進行MTT測定，然后將細胞在37℃孵育4 h，加入150 μl二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，37℃孵育10 min，最后，使用酶標儀測定波長490 nm的吸光度(OD 490 nm)。

1.7 細胞凋亡測定 根據Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒的說明，通過流式細胞儀分析A375細胞凋亡。調整轉染后的A375細胞密度為1×106個/ml，分別加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室溫避光反應15 min，上機檢測。

1.8 Transwell遷移、侵襲實驗

1.8.1 Transwell遷移實驗：用于鑒定A375細胞的遷移能力，收獲轉染后的A375細胞并懸浮在不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，總計5×104個細胞置于Transwell上室。將含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為化學引誘劑添加至Transwell下室。孵育24 h后，使用棉簽輕輕擦去非遷移性細胞。將遷移性細胞用4%甲醛在37℃固定15 min，并用0.1%結晶紫在37℃染色30 min，統(tǒng)計遷移細胞數。

1.8.2 Transwell侵襲實驗：用于鑒定A375細胞的侵襲能力，事先用50 μl與無血清培養(yǎng)基混勻的Matrigel包被Transwell上室，靜置3～4 h。其余步驟同Transwell遷移實驗。

1.9 生物信息學分析和熒光素酶報告基因測定 數據庫TargetScan(http://www.targetscan.org/)預測出SOCS1是miR-582-5p的靶標之一。分別構建SOCS1的野生型(WT)和突變型(MUT)3’非編碼區(qū)(3’untranslated region，3’UTR)質粒，標記為WT-SOCS1、MUT-SOCS1，利用Lipofectamine 2000將miR-582-5p或miR-con共轉染入A375細胞，轉染48 h測定熒光素酶活性。

2 結果

2.1 miR-582-5p 和SOCS1在人黑色素瘤細胞和人類皮膚黑色素細胞中的表達 qPCR檢測數據顯示，miR-582-5p在人黑色素瘤細胞株A375、G361、WM35、M14細胞中的表達量明顯低于人類皮膚黑色素細胞NHEM細胞(P<0.05)，選擇miR-582-5p表達量最低的A375細胞開展后續(xù)實驗。對SOCS1 mRNA和SOCS1蛋白表達的檢測結果表明，A375、G361、WM35、M14細胞中SOCS1 mRNA和SOCS1蛋白表達量顯著高于NHEM細胞(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western blot檢測黑色素瘤細胞和人類皮膚黑色素細胞中SOCS1的表達

表1 miR-582-5p 和SOCS1在人黑色素瘤細胞及人類皮膚黑色素細胞中的表達

2.2 miR-582-5p過表達對人黑色素瘤細胞A375增殖和細胞凋亡的影響 在A375細胞中轉染miR-582-5p，其表達量較miR-con組大幅升高(P<0.05)。MTT對A375細胞增殖的檢測結果表明，與miR-con組比較，miR-582-5p過表達對24 h的細胞活性無明顯影響，而顯著降低48 h、72 h的細胞活性(P<0.05)。流式細胞術檢測A375細胞凋亡，結果顯示，miR-582-5p過表達較miR-con組明顯提高細胞凋亡率(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 miR-582-5p過表達對人黑色素瘤細胞A375凋亡的影響

表2 miR-582-5p過表達對人黑色素瘤細胞A375增殖和凋亡的影響

2.3 miR-582-5p過表達對人黑色素瘤細胞A375遷移和侵襲的影響 Transwell小室法檢測細胞A375遷移和侵襲，結果表明，與miR-con組比較，miR-582-5p過表達明顯減少遷移細胞數和侵襲細胞數(P<0.05)。Western blot檢測細胞A375中N-cadherin、E-cadherin、Vimentin表達，發(fā)現miR-582-5p過表達組N-cadherin、Vimentin表達量顯著低于miR-con組，E-cadherin蛋白水平明顯高于miR-con組(P<0.05)。見圖3，表3。

表3 miR-582-5p過表達對人黑色素瘤細胞A375遷移、侵襲的影響

圖3 miR-582-5p過表達對人黑色素瘤細胞A375遷移、侵襲的影響；A Transwell檢測人黑色素瘤細胞A375遷移和侵襲；B Western blot檢測N-cadherin、E-cadherin、Vimentin的表達

2.4 miR-582-5p靶向調控SOCS1的表達 生物信息學預測miR-582-5p的靶基因，結果顯示，SOCS1的3’UTR中部分核苷酸序列可與miR-582-5p 互補配對。雙熒光素酶報告實驗檢測發(fā)現，與miR-con組比較，miR-582-5p明顯降低WT-SOCS1的熒光素酶相對活性(P<0.05)，但對MUT-SOCS1的熒光素酶相對活性無顯著影響。Western blot檢測SOCS1蛋白的表達，結果表明，miR-582-5p比miR-con組明顯減少SOCS1蛋白表達量(P<0.05)，anti-miR-582-5p較anti-miR-con組顯著提高SOCS1蛋白水平(P<0.05)。見圖4，表4、5。

圖4 miR-582-5p 靶向調控SOCS1的表達;A SOCS1的3’UTR中含有與miR-582-5p 互補的核苷酸序列；B Western blot檢測人黑色素瘤細胞 SOCS1蛋白表達

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5 過表達SOCS1逆轉了miR-582-5p 過表達對人黑色素瘤細胞A375增殖、遷移、侵襲和凋亡的調控作用與miR-con組比較，miR-582-5p過表達明顯降低A375細胞48 h、72 h的細胞活性、遷移細胞數、侵襲細胞數、SOCS1、N-cadherin和Vimentin蛋白水平(P<0.05)，顯著增加細胞凋亡率、E-cadherin蛋白表達量(P<0.05)。同miR-582-5p +pcDNA組相比，miR-582-5p 和 pcDNA-SOCS1共轉染明顯提高A375細胞48h、72h的細胞活性、遷移細胞數、侵襲細胞數、SOCS1、N-cadherin和Vimentin蛋白水平(P<0.05)，顯著減少細胞凋亡率、E-cadherin蛋白表達量(P<0.05)。見表6、7，圖5。

圖5 Western blot檢測人黑色素瘤細胞A375中SOCS1、N-cadherin、Vimentin和E-cadherin的表達

表5 miR-582-5p 調控SOCS1蛋白的表達

表6 過表達SOCS1逆轉了miR-582-5p 過表達對人黑色素瘤細胞A375增殖、遷移、侵襲和凋亡的調控作用

3 討論

在所有皮膚腫瘤中，黑色素瘤是最具侵襲性的一種，因為它具有快速轉移性、對傳統(tǒng)放射線和化療的耐藥性[15]。黑色素瘤也是皮膚癌死亡的主要原因，更全面地了解黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制對于提高該病的診斷、預后和治療至關重要。考慮到早期發(fā)現黑色素瘤的存活率更高，早期發(fā)現黑色素瘤的精確診斷測試將十分有利。此外，由于當腫瘤轉移時，患者的存活率急劇下降，因此有必要改進診斷工具，更精確地識別高危患者并預測治療反應。

表7 過表達SOCS1逆轉了miR-582-5p過表達對人黑色素瘤細胞中SOCS1、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin表達的影響

miRNA是高度保守的短鏈RNA，由18到25個核苷酸組成[16]，具有廣泛的生物活性。miRNA通過與下游靶基因3’UTR的特定序列結合，導致mRNA降解和/或翻譯抑制，在許多細胞過程，如增殖、分化、細胞衰老、自噬和遷移等發(fā)揮重要作用[17]。已經在各種類型的惡性腫瘤中鑒定出miRNA異常表達，包括黑色素瘤[18]。因此，研究黑色素瘤相關miRNA的作用和潛在的分子機制對于開發(fā)新的診斷生物標志物和有效的治療靶標是必不可少的。本實驗檢測了miR-582-5p在黑色素瘤中的表達水平，確定miR-582-5p在黑色素瘤發(fā)展中的詳細作用。結果顯示，miR-582-5p在人黑色素瘤細胞株A375、G361、WM35、M14細胞中表達明顯下調，這與其在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)臨床標本和細胞系中表達下調的結果一致[19]。同時，Wang等[19]的研究還發(fā)現，miR-582-5p過表達顯著抑制體外NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲，其發(fā)揮腫瘤抑制活性與靶向調控絲裂原活化蛋白激酶激酶2(mitogen activated protein kinase kinase 2，MAP3K2)基因有關。Liu等[20]學者也觀察到miR-582-5p在NSCLC組織中的表達低于癌旁組織；miR-582-5p的異位表達顯著抑制NCI-H358細胞增殖和侵襲；miR-582-5p下調時則相反，細胞生長速度加快，PC-9細胞侵襲能力增強。Zhang等[21]報道指出，miR-582-5p在肝癌組織和細胞系中表達下調，在G0/G1期上調miR-582-5p可減少菌落數量，抑制細胞增殖，抑制細胞周期；當miR-582-5p被抑制時，菌落數量增加，細胞增殖和細胞周期得到促進。本研究中，功能實驗表明，miR-582-5p過表達明顯抑制黑色素瘤細胞A375的增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡，與前述研究相符。

與胚胎發(fā)育相似，EMT的細胞表型變化也在致瘤過程中發(fā)揮作用[22]。EMT過程是促進腫瘤進展和轉移的重要現象，構成了腫瘤細胞表型特征的改變，使其具有更強的侵襲性[23]。Wang等[24]利用微陣列分析顯示，與匹配的鄰近正常組織相比，涎腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)樣本中miR-582-5p顯著下調；miR-582-5p表達通過靶向叉頭框C1(forkhead box C1，FOXC1)顯著影響細胞的遷移、侵襲和增殖能力；隨著FOXC1的下調，E-cadherin升高，而Vimentin和snail蛋白降低，說明FOXC1可能通過使snail轉活來調控SACC細胞的EMT。本研究中，miR-582-5p過表達明顯降低A375細胞的N-cadherin、Vimentin蛋白表達，顯著提高E-cadherin蛋白水平(P<0.05)，表明miR-582-5p對黑色素瘤細胞的EMT過程具有抑制作用。

幾種基因已被確定為miR-582-5p的直接靶標，包括AKT3[9,10]、Rab27a[11]、MAP3K2[19]、缺口受體1(notch receptor 1，NOTCH1)[20]、細胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin dependent kinase 1，CDK1)[21]。本實驗對miR-582-5p調節(jié)黑色素瘤發(fā)展的潛在分子機制展開進一步研究。通過生物信息學預測和雙熒光素酶報告實驗，證實SOCS1是黑色素瘤細胞中miR-582-5p的直接靶標。SOCS1屬于SOCS家族，是癌癥發(fā)生的關鍵基因。先前報道，與正常卵巢組織相比，卵巢癌標本中SOCS1 mRNA和蛋白表達水平明顯升高(P=0.0215)[25]，與本研究結果一致。研究表明，SOCS1有利于黑色素瘤EMT，促進腫瘤進展，抑制抗腫瘤免疫；調控程序性細胞死亡1配體1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)表達可能解釋了這些作用；SOCS1的沉默導致B16F10-Nex2黑色素瘤細胞的致瘤表型部分逆轉，抑制了細胞的遷移和侵襲[26]，提示靶向SOCS1可能是治療黑色素瘤患者一種有前景的方法。

總之，miR-582-5p在黑色素瘤中表達下調，miR-582-5p過表達通過直接靶向SOCS1調控黑色素瘤細胞A375的增殖、遷移、侵襲、凋亡和EMT，為黑色素瘤的治療提供了潛在的生物標志物和有效靶點。