加替沙星對映異構體拆分研究*

陳 希，鄢雷娜，劉緒平，段和祥，陳偉康

（江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌330029）

當前對映異構體（對映體）的拆分方法主要包括高效液相色譜法（HPLC）、毛細管電泳法（CE），其中HPLC 法又分為柱前衍生法、手性流動相添加法和手性固定相法[1-6]。柱前衍生法前處理復雜且時間長；以CuSO4和手性氨基酸為手性流動相的方法已普遍用于喹諾酮類藥物對映體的拆分，原理為待測物可與Cu2+及手性氨基酸形成三元非對映體配位化合物而分離，該法適用于手性碳原子與手性配合部位距離較近的化合物分離，如氧氟沙星、帕珠沙星等，但對于手性碳與手性配合部位距離較遠的藥物卻無法拆分，如手性碳在哌嗪側鏈上的洛美沙星和加替沙星，熊正平等嘗試采用過L-脯氨酸與CuSO4的手性流動相添加劑法來拆分洛美沙星對映體未能成功[7-9]。

手性固定相法利用藥物對映體和固定相之間所形成的非對映體復合物穩定性差異而實現對映體的拆分，雖然手性色譜柱較貴，但優點是適用于不含活潑反應基團的化合物，且樣品處理步驟簡單，現已廣泛應用在藥物對映體拆分上[10,11]。本文利用以鍵合了苯基氨基甲酸酯化β-環糊精的手性色譜柱（Chiral CD-Ph）對加替沙星對映體進行了拆分研究。

圖1 加替沙星的化學結構式Fig.1 Chemical structure of gatifloxacin

1 材料

1.1 儀器

島津LC-AD 高效液相色譜儀，METTLER MS205DU 電子天平。

1.2 藥品與試劑

加替沙星對照品（來源：中國食品藥品檢定研究院，批號：130518-200402，含量：97.2%；旋光度測定為0°，認為左右旋加替沙星比例為1∶1）；加替沙星片（湖北潛江制藥股份有限公司，批號180801）；水為純化水，HClO4和NaClO4為分析純，甲醇、乙腈為色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

流動相：0.5mol·L-1NaClO4溶液（用HClO4調節pH 值至4.0）-甲醇（53∶47）；流速：1.0mL·min-1；色譜柱為Chiral CD-Ph（4.6mm×250mm，5μm）；柱溫40℃；進樣量10μL；檢測波長：292nm。

2.2 溶液的制備

精密稱取加替沙星對照品適量，加50%的甲醇溶解并稀釋成含加替沙星約為2mg·mL-1的對照品溶液。取加替沙星片研細，精密稱取適量，用50%的甲醇溶解并稀釋成含加替沙星約為1mg·mL-1的供試品溶液。

2.3 鹽和有機相的選擇

分別以甲酸銨、KH2PO4和NaClO4作為流動相對加替沙星進行拆分，結果顯示甲酸銨和KH2PO4系統均無法拆分加替沙星，而NaClO4系統有拆分加替沙星的可能。以NaClO4為水相，分別以甲醇和乙腈為有機相對加替沙星進行拆分，結果顯示乙腈拆分效果很差，幾乎無法拆分加替沙星，而甲醇拆分效果較好，最終選擇甲醇進行研究。

2.4 NaClO4 濃度的選擇

以NaClO4-甲醇為流動相，嘗試NaClO4濃度為0.1、0.3 和0.5mol·L-1時對拆分結果的影響，結果兩對映體間分離度分別為1.092、1.483 和1.602，最終選擇濃度為0.5mol·L-1的HClO4進行研究。

2.5 甲醇比例的選擇

甲醇50%時對映體保留時間約為34min，對映體間分離度1.498；加大甲醇比例兩對映體間分離度更小，減少比例分離度有加大趨勢，但保留時間太長，綜合考慮選擇甲醇比例為47%進行研究。

2.6 系統適應性實驗

對照品溶液，按“2.1”中色譜條件進行測定，色譜圖詳見圖2。圖譜顯示加替沙星兩個對映體間保留時間分別約為34 和39min，兩對映體峰間的分離度為1.6，符合《中國藥典》2015 年中待測物質色譜峰間的分離度應大于1.5 的要求[12]。

圖2 加替沙星對照品色譜圖Fig.2 Gatifloxacin reference chromatogram

2.7 線性關系考察

取對照品溶液適量，分別加50%甲醇分別稀釋成含加替沙星100、250、500、750、1000 和1500μg·mL-1的溶液（單個對映體濃度為加替沙星濃度的50%），按“2.1”中色譜條件進行測定，記錄色譜圖。以加替沙星單個對映體的峰面積為縱坐標（y），加替沙星單個對映體的濃度為橫坐標（x）繪制標準曲線。結果表明，加替沙星單個對映體濃度在50～750μg·mL-1之間與相應峰面積呈良好線性關系。對映體1 回歸方程為：y=52819x+44509，r2=0.9999；對映體2 回歸方程為：y=56850x+404273，r2=0.9999。

2.8 精密度和重復性

取加替沙星濃度約為1mg·mL-1的對照品溶液，按“2.1”中色譜條件連續進樣6 針，記錄色譜圖。按“2.2”中方法分別制備6 份供試品溶液，按“2.1”中色譜條件分別進樣，記錄色譜圖。分別計算加替沙星每個對映體峰面積的RSD，結果均小于1%，說明本方法精密度和重復性良好。

表2 精密度和重復性測定結果Tab.2 Results of precision and repeatability

2.9 定量限與檢出限考察

取對照品溶液倍比稀釋，按“2.1”中色譜條件測定，以信噪比滿足3∶1 和10∶1 計算檢出限和定量限。結果本方法加替沙星單個對映體的檢出限和定量限分別為1.5 和5μg·mL-1。

2.10 樣品測定

取供試品溶液按“2.1”中色譜條件測定，記錄色譜圖。結果供試品中對映體1 和對映體2 峰面積比值平均為48.3∶51.7，與對照品溶液對映體峰面積比接近，表明供試品溶液中兩對映體含量近似一致。

3 結論

本研究使用手性色譜柱Chiral CD-Ph 成功拆分了加替沙星對映體，以0.5mol·L-1NaClO4溶液（pH 值4.0）-甲醇（53∶47）為流動相時，加替沙星兩個對映異構體分離度最佳，解決了手性流動相方法無法拆分加替沙星的難題。該方法樣品前處理簡單，精密度和重復性良好、靈敏度高，可用于加替沙星光學純度的測定和質量控制。