新興技術在沙丁胺醇殘留檢測中的應用進展*

李紅杰

（天津大學 藥物科學與技術學院，天津300072）

β－興奮劑（β-agonist）全稱是β－腎上腺素興奮劑，或又稱β－激活劑，是一種苯乙醇類衍生物（分子結構見圖1），在臨床中主要用于治療哮喘等支氣管類疾病，后來被用于畜禽行業，提高牲畜的瘦肉率，β－興奮劑類物質代謝后易在動物內臟器官內殘留，進而引起了屢禁不止的食物中毒事件，因此，成為了國內外禁用的化學物質之一。常見的β－興奮劑種類包括克倫特羅，沙丁胺醇，萊克多巴胺等，在其中代謝最快、最不易被檢測到的物質即為沙丁胺醇（Salbutamol，SAL）[1]。

沙丁胺醇（分子式：C13H21NO3）屬于苯胺類物質，又稱為舒喘寧，化學名稱為1-（4-羥基-3-羥甲基苯基）-2-（叔丁氨基）-乙醇（分子結構見圖1），其硫酸鹽易溶于水，在體內較克倫特羅等更易被代謝，從而增加了后期藥物的檢測難度。全文綜述了沙丁胺醇類興奮劑殘留的檢測現狀，除了沙丁胺醇等物質的前處理方法總結外，還分別從化學，生物，代謝產物等方面，綜述了新興技術在沙丁胺醇殘留最新檢測方法中的應用，并對其檢測前景做出預測，為沙丁胺醇等β－興奮劑違規使用的檢測研究提供了有效依據。

圖1 β－興奮劑和沙丁胺醇的分子結構Fig.1 Structural formula of β - agonists and salbutamol

1 沙丁胺醇殘留物的檢測現狀

為了嚴格控制各種β－興奮劑的違規使用，建立快速，簡便，有效的殘留物檢測方法是化學、生物研究領域的重點問題。常見的檢測方法包括酶聯免疫吸附法（ELISA）、氣相色譜法-質譜聯用法（GCMS）、液相色譜-質譜法（LC-MS/MS）、高效液相色譜法（HPLC）和毛細管電泳分離檢測法（CZE）等，在快速檢測方法中，已經有多種試劑檢測盒，試劑檢測試紙應用于藥物的快速檢測，膠體免疫金層析法近幾年被廣泛用于藥品、食品的檢測中，主要是用膠體金標記樣品中的生物大分子，將色譜層析技術和免疫抗原抗體的特異性反應二者相結合的一種檢測技術。韓京朋等[2]制備的用來檢測尿液中沙丁胺醇殘留的膠體金免疫試紙條，檢測限已經降低至3.0μg·L-1，可在5min 內快速鑒定出肉眼可識別的結果，被用于現場定性和半定量檢測和快速篩選。吳雨豪等[3]建立了膠體金免疫層析新方法，通過制備65nm 多枝狀膠體金（金納米花）新型探針來檢測豬尿中的沙丁胺醇，最低檢測限降低至0.027ng·mL-1。膠體金免疫層析法成本低且快速，但是會出現假陰性、假陽性等現象。另外，鄭宏偉等[4]建立了簡便、快速、靈敏度高的沙丁胺醇ELISA 試劑盒檢測技術，此檢測試劑盒的最低檢測限為0.1×10-9，適用于大批量樣品中沙丁胺醇的現場快速檢測。這些方法在化學、生物分析領域，以及藥物殘留的檢測中較常見，于是全文對這幾種方法將不再展開多余的闡述，僅僅針對新興技術產業在沙丁胺醇殘留檢測方法的應用進行簡要介紹。

2 沙丁胺醇殘留的前處理

沙丁胺醇等藥物殘留的前處理方法，與蔬菜中農藥殘留分析相比，相對快速簡單的前處理方法所用有限。在檢測中也多使用在農藥殘留中常見的固相微萃法（SPME），液-液萃取技術（LLE）、基質固相萃取技術（MSPD）等方法。最近幾年，另外幾種前處理方法也見于獸藥殘留檢測如沙丁胺醇中，如QuECHERS （Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）技術，分子印跡分析技術，酶解法等。QuECHERS 技術通過選用合適的具有吸附作用的吸附劑對藥物或者雜質進行吸附，作用原理與高效液相和固相萃取技術類似，但是更好的提高了目標分辨率和靈敏度，增強了方法的實用性[5]。鄭玲等[6]采用QuEChERS 方法進行沙丁胺醇等18 種β－興奮劑的檢測前處理，通過優化QuEChERS 方法過程中試劑條件，如將QuEChERS 方法中常用乙腈或酸化乙腈等提取試劑優化成了4%（v/v）氨水乙腈、將PSA、C18及石墨化炭黑（GCB）等常用的吸附劑通過實驗組合成25mg C18+50mg PSA 的凈化劑等，同時將一些質譜儀器條件也進行了優化，這些改變不僅提高了回收率，而且提高了整個檢測過程的靈敏度和效率。在樣品前處理過程中，分子印跡法（MIT）也常常發揮其高親和力、高特異性和高穩定性等優勢。另外，趙文成等[7]采用酶解法對樣品進行前處理，通過對酶解時間、溫度以及衍生化條件等進行一系列實驗細節優化，得到了8h 的最佳酶解時間、40℃最佳酶解溫度，從而在沙丁胺醇等一系列β-興奮劑的檢測實驗中獲得了較高的提取率。

3 沙丁胺醇殘留的最新檢測方法

3.1 化學檢測

3.1.1 化學分析法 化學分析法是化學成分檢測中常見的分析途徑，由于操作簡單、準確度高、設備成本低等優點而被人們廣泛使用，在常量元素的分析測定方面更是具有方便快捷的特點[8]。在農藥殘留成分檢測中常見的是滴定分析，如EDTA 絡合滴定法。興奮劑類藥物殘留常見于動物肌肉，血液，尿液，毛發等排泄物中，肌肉等組織構造復雜，代謝產物繁雜等增加了化學分析法檢測的難度，在獸藥成分殘留的檢測中，以及農藥殘留檢測中常用的化學滴定法并不常用，這些易操作的化學分析檢測方法在獸藥殘留成分的檢測中仍有待發展。

化學發光檢測也是化學分析中重要的研究手段，通過建立化學發光體系，以及一系列化學發光物質進行化學成分的檢測已經成為了實驗室的關于β－興奮劑的研究熱點。董曉等[9]通過建立Ni（IV）-魯米諾流動注射化學發光體系，在堿性條件下，對魯米諾溶液濃度和堿度、Ni（IV）溶液濃度和堿度進行了優化，分別測定了沙丁胺醇在硫酸鹽，尿液和飼料中含量，并且確定沙丁胺醇檢測限范圍為1.0×10-9～5.0×10-7mol·L-1，檢出限為1.0×10-11mol·L-1。這種建立化學發光體系的檢測方法簡單，快速且靈敏，可被廣泛應用于化學和生物領域。

3.1.2 儀器分析法 在光譜分析中，紅外光譜分析法，紫外光譜分析法，熒光傳感器檢測技術和分光光度檢測技術被廣泛應用于各類β－興奮劑的檢測方法中。紅外光譜分析法是一種借助紅外光譜特征譜圖對沙丁胺醇等藥物殘留進行分析、鑒定的無損化技術。與其他的檢測技術相比，紅外光譜分析法無需樣品前處理過程，具有操作快速簡潔，準確等優點，現廣泛被用作農獸藥殘留檢測的分析手段。

在色譜檢測方法中，通常用到的色譜方法有氣相色譜法，液相色譜法，薄層色譜法，高效液相色譜法，毛細管電泳法等。色譜法在沙丁胺醇等殘留的檢測中發展較為成熟，如色譜-質譜聯用技術作為一種廣泛被應用于藥物殘留檢測的分析方法具有靈敏度高，可以很快的定性定量等優點。普通的液相色譜-串聯質譜聯用分析方法可以用于不超過幾十種藥物的檢測，對于高通量藥物的篩選，田懷香[10]等利用一種高效液相色譜-串聯飛行時間質譜（HPLC-TOFMS /MS）聯用的化學分析方法檢測了乳制品中包括β-興奮劑類、大環內酯類、非甾體類消炎藥等174種獸藥品的殘留，通過Poroshell 120 EC-C18柱進行分離，以及0.1%甲醇和甲酸流動相進行洗脫后采用正離子模式進行采集，可將檢測限降低為1～10ng·g-1，同時質控樣品種類數目可達99 種，這種高通量篩選的方法不僅提高藥物檢測的靈敏度，而且大大提高乳制品中藥物殘留篩選的效率。但是各種色譜法中使用的儀器設備較為昂貴，且對專業人員的技術操作有一定的要求，因此，色譜法多用于實驗室精密檢測，在沙丁胺醇等獸藥殘留的現場快速檢測中應用較少。

3.2 生物檢測

生物檢測除了80 年代以來常用到的酶抑制法（EI），膠體金免疫層析法（CGIA），化學發光免疫分析法（CLIA）、熒光免疫分析法( FIA)、放射免疫層析法( RIA)等免疫分析技術[11]外，20 世紀以來又新增了生物傳感器技術，新型生物芯片技術，單克隆抗體等檢測方法。

3.2.1 生物傳感器（biosensor, BS）技術 生物傳感器技術是一項多學科交叉使用的新型微量分析技術，在快速檢測技術上表現出巨大的發展優勢。它通常以酶，抗原抗體，細胞等活性敏感材料作為識別元件，經過一系列濃度反應變化后轉換成相應的電信號，呈現在傳感器中并顯示記錄下來[12]。生物傳感器分為電化學傳感器，光纖傳感器等。如單學凌等[13]采用RuSiNPs/SnO2復合膜去修飾玻碳電極，制備了一種增敏型電化學發光生物傳感器來檢測沙丁胺醇殘留成分，顯著的提高了分析靈敏度。雖然生物傳感器具有很高的靈敏度和穩定性，但是檢測范圍較狹窄，僅應用于單一成分的檢測。生物傳感器技術與計算機相結合，實現進樣，檢測分析等自動化是生物傳感器技術未來的發展方向。

3.2.2 生物芯片（biochip）技術 生物芯片技術是應用玻璃片，硅片等材料固定樣本，然后通過微加工技術對蛋白質，核酸等一系列大分子進行檢測的新興技術。在20 世紀末開始使用的新型生物芯片產品——液相芯片技術是一種基于熒光微球探針的多功能分析技術，主要有靈敏度高、檢測速度快等優點，既可以對大量樣品進行分析，又擴大了樣品中的篩選范圍。梁世正等[14]利用液相懸浮芯片技術同時檢測了萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅和沙丁胺醇3 種β-興奮劑的殘留成分，分別用3 種藥物抗原偶聯到不同的熒光微球上作為探針，將藻紅蛋白（PE）熒光標記二抗作為信號，通過建立標準曲線分別同時檢測3 種藥物，其中沙丁胺醇的檢測范圍是1～100μg·L-1，檢出限0.88μg·L-1，這種方法的特異性較強且通量高，故可用于多成分的殘留檢測。近年來，我國在生物芯片技術領域取得了一定的突破性進展，其在農獸藥安全檢測方面，具有廣闊的應用前景。

3.3 首要代謝產物的檢測

沙丁胺醇在人體中主要的代謝途徑是通過與硫酸鹽結合從尿液中排出體外。從沙丁胺醇代謝物殘留的角度去分析與檢測，通過選擇合適的靶標和標記物監測沙丁胺醇的代謝殘留物也不失為一種檢測途徑。Kai Zhang 等[15]通過UHPLC-QTOF-MS/MS 監測了牛的體液和腎臟等器官中沙丁胺醇的10 種代謝產物，雖然發現6 種最新的代謝產物，但是10 種代謝產物中均未發現與硫酸鹽結合的產物，分析可能是動物腸道的微生物所具有的復雜的消化特質導致的。這種檢測結果說明在沙丁胺醇的檢測中，檢測標記物選取母核藥物或總結合藥物殘留由選取的不同個體決定，這類研究在沙丁胺醇代謝物殘留的檢測中具有一定參考價值。

3.4 其他檢測方法

3.4.1 電化學檢測 電化學檢測方法通過改變化學電池、化學電極的參數，來監測溶液濃度的變化進而達到檢測的目的。在沙丁胺醇殘留成分的檢測中，電化學法往往通過改變電極修飾材料的方法而提高檢測的靈敏性。分子印跡法（MIT）憑借其簡單的制備方法和優良的理化性質被廣泛應用于多種分子的電化學檢測方法中，任慧鵬等[16]應用改良后的電化學傳感方法對沙丁胺醇進行檢測，通過對分子印跡膜（MIM）電流型傳感檢測、TCNQ 膠體金電流型傳感檢測、MIM 電導傳感檢測法、石墨烯-納米金等4 種修飾電極的方法進行比較后發現，沙丁胺醇分子印跡膜（MIM）修飾電極的電導傳感檢測法最具使用價值，檢測限范圍為0.5～15mg·L-1，檢測下限可降至0.03mg·L-1，可以應用于大批量的沙丁胺醇的現場檢測工作中。杜平等[17]利用納米金和硫堇的良好導電性能來對玻碳電極表面進行了修飾，制成了納米金/聚硫堇/沙丁胺醇分子印跡電化學傳感器，這種類型的電化學傳感器特異性強，具有很強的抗干擾能力。電化學檢測法靈敏度較高，但是檢測過程中用來修飾電極的材料普遍特殊，需要較高的專業操作技術，所以不易推廣。

3.4.2 材料改造型檢測 在材料工程方面，隨著納米材料的發展，多學科交叉的快速檢測方法在基于納米材料改造技術上的發展趨勢日益明顯，納米結構型材料逐漸被應用于各種實用的檢測方法中，例如碳納米管快速檢測法，表面等離子體共振（SPR）生物傳感器等檢測方法。在傳統的拉曼散射（SERS）芯片襯底材料中，一般使用表面等離激元活性較強的Au、Ag 等貴金屬材料，而班榕檉等[18]采用了TiN等激元活性材料后，成功的制備出TiN/Ag 雙殼層陣列結構芯片，提高了SERS 芯片檢測的靈敏度和穩定性，明顯拓寬了生物檢測的檢測域，同時在沙丁胺醇等β－興奮劑的檢測中也得到了很有效的應用，通過比較SERS 芯片檢測方法和色譜-質譜聯用技術各自獲得的回收率，進一步分析得出了SERS 芯片檢測的可行性和實用性。王晨晨等[19]利用金屬納米材料的穩定性高，可塑性佳，且生物相容性好等優點制備了表面離子共振生物傳感器，利用沙丁胺醇抗原抗體相互作用的原理展開了沙丁胺醇殘留的現場快速檢測，檢出限為1.2ng·mL-1。Malahom 等[20]在采用新型紙基比色免疫測定法（PCI）測定豬尿液中沙丁胺醇殘留時，利用Ag3PO4/Ag 納米復合材料與反應底物的親和性，將Ag3PO4/Ag 納米復合材料作為標記材料提高了紙基ELISA 方法的靈敏性和特異性。納米材料等材料改造型檢測與其他檢測方法的交叉使用，將成為沙丁胺醇等藥物殘留檢測方法未來發展的主要趨勢。

4 展望

沙丁胺醇等藥物的長期使用將引起心腦血管等一系列問題，甚至致死。各地政府均對沙丁胺醇的使用量進行了明確規定，如WHO 規定沙丁胺醇的最大殘留量不超過0.2μg·kg-1，在中國，政府嚴禁在畜牧業中使用沙丁胺醇等藥物。因此，沙丁胺醇殘留的檢測具有很深刻的研究意義。沙丁胺醇殘留的常見檢測方法如色譜法，酶聯免疫法，免疫分析法等，操作過程復雜，檢測成本偏高，而且有些方法不能對樣品成分進行立即準確的驗證，現在各種新興的檢測方法越來越趨向于多學科技術的交叉融合，例如色譜法和質譜法的聯用，免疫法和層析技術的結合，以及生物傳感技術與多種技術的結合使用，多種方法的聯合使用不僅可以克服單一技術的不靈敏性，而且可以擴大檢測范圍，降低檢測限。因此，建立具有檢測耗時短、靈敏度高、自動化水平高、無需專業人員操作等特點的檢測方法，是沙丁胺醇以及其他新型β－興奮劑殘留檢測方法的最新發展方向。