miR-205和miR-944在宮頸癌患者血清中的表達及其臨床意義

嚴曉春 李玥 何飛燕 胡曉華

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，其發病率及病死率較高，已成為世界范圍內女性生殖系統惡性腫瘤死亡的主要原因[1]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）作為一種內源性、非編碼小分子RNA，參與細胞的增殖、分化、凋亡和新陳代謝等過程，在惡性腫瘤的發生發展中起到重要作用[2，3]。近年來研究發現，miR-205及miR-944在子宮內膜癌中異常表達，參與子宮內膜癌的發生發展，并有望作為子宮內膜癌早期診斷及預后評估的生物學指標[4，5]。但miR-205及miR-944能否作為診斷宮頸癌的新型生物學標志物，目前尚未明確。本研究通過分析宮頸癌患者血清miR-205及miR-944的表達水平與臨床病理指標的關系，探討miR-205及miR-944對宮頸癌的診斷價值，旨在為宮頸癌的診斷及靶向治療提供參考依據。

資料與方法

1 研究對象 選取2017年1月～2019年12月上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院收治的宮頸癌患者162例（宮頸癌組），年齡32～74（47.35±9.62）歲。納入標準：①符合國際婦產科聯合會（FIGO）分類標準[6]，且經病理確診為宮頸癌者；②術前均未接受放射治療、化療或生物免疫治療者；③能配合本次研究及病歷資料完整者。排除標準：①隨訪過程中失訪，病例資料不完整者；②術前已行放療、化療或生物免疫治療者；③術前有急慢性感染性疾病、血液系統疾病、自身免疫性疾病及合并其他惡性腫瘤者。162例宮頸癌患者的臨床分期：I期87例，Ⅱa期50例，Ⅱb期25例；病理類型：鱗狀細胞癌142例，腺癌20例；有淋巴結轉移34例，無淋巴結轉移128例。另取同期CIN患者85例作為CIN組和健康體檢女性65例作為對照組。三組間年齡、體質指數等一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），組間具有可比性。本研究獲得醫院倫理委員會批準，并與患者或家屬簽署知情同意書。

2 引物設計與合成 miR-205引物，上游：5'-AGAACTTATACTGAGTGAGG-3'，下游：5'-GAAGTCAAGATCGAATTG-3'；miR-944引物，上游：5'-GTCCAGCAGATGACTCAATG-3'，下游：5'-ATCCATGAAGCATACGTG-3'。

3 miR-205及miR-944檢測 所有研究對象均于清晨抽取空腹靜脈血5 mL置于未加抗凝劑的離心管中，于室溫2500 r/min離心15 min，吸取上層血清400 μL，加入1 mL提取劑（Trizol），于-70 ℃保存。在ABI 7500型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）上進行實時熒光定量PCR。以U6為內參，miRNA逆轉錄反應體系15 μL：5 μL RNA模板，3 μL U6及miRNA特異性莖環引物，0.15 μL 100 mmol/L脫氧核糖核苷酸(dNTPs)，1 μL逆轉錄酶（50 U/μL），1.50 μL反轉錄緩沖液（10×），0.19 μL RNase抑制劑（20 U/μL），4.16 μL無菌三蒸水。反應條件：16℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。擴增反應體系20 μL：1 μL引物及探針Mix（20×），10 μL TaqMan通用混合物溶液（2×），1.33 μL反轉錄產物cDNA，7.67 μL無核酸酶的水。每個反應體系中熒光信號達到設定閾值所經歷的循環數即為Ct值，采用2-△△Ct法計算miR-205及miR-944相對表達水平，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。

4 統計學處理 應用SPSS20.0統計軟件分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；兩獨立樣本均數的比較采用成組t檢驗。繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）分析血清miR-205及miR-944對宮頸癌的診斷價值，曲線下面積（area under cure，AUC）比較采用Z檢驗。相關性分析采用Pearson相關分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 各組血清miR-205及miR-944表達水平比較 宮頸癌組血清miR-205及miR-944表達水平明顯高于CIN組和對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；而且CIN組血清miR-205及miR-944表達水平明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

2 宮頸癌患者血清miR-205及miR-944表達水平與臨床病理特征的關系 宮頸癌患者血清miR-205及miR-944表達水平與臨床分期、浸潤深度及淋巴結轉移有關（P＜0.05），而與年齡、絕經、病理類型、分化程度、腫瘤直徑及脈管浸潤無關（P＞0.05）。見表2。

表1 各組miR-205及miR-944表達水平比較（±s）

表1 各組miR-205及miR-944表達水平比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與CIN組比較，bP＜0.01

組別 n miR-205 miR-944對照組 65 0.14±0.10 0.03±0.01 CIN組 85 0.71±0.13a 0.46±0.02a宮頸癌組 162 1.25±0.61ab 0.82±0.38ab F值 10.148 8.217 P值 ＜0.001 ＜0.001

表2 宮頸癌患者血清miR-205及miR-944表達水平與臨床病理特征的關系

3 血清miR-205及miR-944對宮頸癌的診斷價值 血清miR-205及miR-944水平診斷宮頸癌的最佳截斷值分別為0.94、0.53。兩項聯合診斷宮頸癌的AUC為0.926（95%CI：0.864～0.985）明顯高于單項miR-205（0.831，95%CI：0.774～0.890）及miR-944（0.802，95%CI：0.741～0.859），差異有統計學意義（Z=5.820，6.205，P＜0.05），其敏感度和特異度為92.0%和88.7%。見表3和圖1。

4 各組研究對象血清miR-205與miR-944表達水平的相關性分析 Pearson相關分析顯示，宮頸癌患者血清miR-205與miR-944表達水平呈正相關（r=0.824，P＜0.01）。見圖2。

表3 血清miR-205及miR-944對宮頸癌的診斷價值

圖1 血清miR-205及miR-944診斷宮頸癌的ROC曲線

圖2 宮頸癌患者血清miR-205與miR-944表達水平的相關性分析

討 論

宮頸癌的發生發展是一個極其復雜的多因素、多階段調節過程，近年來其發病率明顯增加，而且呈年輕化趨勢，嚴重威脅女性的生命健康。miRNA是一類長度為21～25 nt的內源性單鏈非編碼RNA分子，可激活多種胞內信號通路，參與調控細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移和分化等過程，影響惡性腫瘤的發生發展，有望成為腫瘤治療的重要靶點[5，7]。有研究表明，miRNA在宮頸癌中異常表達，與宮頸癌的發生、發展、轉移及預后密切相關，可作為宮頸癌早期診斷和預后判斷的新型標志物[8，9]。近年來研究證實，miR-205及miR-944可以通過多種信號通路在惡性腫瘤的發生發展、侵襲、轉移及耐藥等病理過程中發揮重要作用，有可能成為惡性腫瘤診斷、治療和預后判斷的新靶點[10，11]。LIU等[12]研究表明，miR-205參與介導宮頸癌發展過程中的細胞生長、凋亡、遷移和侵襲，miR-205的表達異常在人類宮頸癌的發展中起著重要的促進作用。XIE等[13]研究發現，在宮頸癌組織中，miR-944的含量明顯高于正常對照組，這為其在宮頸癌發生中的作用提供新的信息。

本研究顯示，宮頸癌組血清miR-205及miR-944表達水平均明顯高于CIN組和對照組，而且CIN組血清miR-205及miR-944表達水平明顯高于對照組，提示miR-205及miR-944可能發揮癌基因作用促進宮頸癌的發生發展。本研究中Ⅱa+Ⅱb期宮頸癌患者血清miR-205及miR-944表達水平明顯高于Ⅰ期患者，浸潤深度＞1/2肌層的患者血清miR-205及miR-944表達水平明顯高于深度≤1/2肌層的患者，有淋巴結轉移的患者血清miR-205及miR-944表達水平明顯高于無淋巴結轉移者，表明miR-205及miR-944與宮頸癌較差的臨床病理特征有關。分析其原因可能是臨床病理特征較差的宮頸癌患者病情進展較快，腫瘤負荷較大，腫瘤組織可抑制更多的抑癌基因進入血液，同時可促進機體表達具有癌基因作用的miR-205及miR-944，進而導致miR-205及miR-944水平異常升高。XIE等[14]研究發現，miR-205促進人宮頸癌細胞的增殖和遷移，在宮頸癌的發生及臨床診斷中具有潛在價值。PARK等[15]研究表明，宮頸癌組織miR-944表達水平明顯高于正常組織，且與淋巴結轉移及臨床分期相關，miR-944高表達與宮頸癌患者總生存率較低有關，可作為宮頸癌預后評估的潛在生物標志物。

本研究應用ROC曲線分析顯示，血清miR-205及miR-944診斷宮頸癌的最佳截斷值分別為0.94、0.53，兩項聯合診斷宮頸癌的曲線下面積最大，其敏感度和特異度較高。相關分析顯示，宮頸癌患者血清miR-205與miR-944表達水平呈正相關。這說明miR-205及miR-944可作為診斷宮頸癌的非侵入性生物學標志物，兩項聯合檢測有助于提高對宮頸癌的診斷價值。MA等[16]研究顯示，宮頸癌患者血清miR-205水平顯著升高，且與淋巴結轉移和腫瘤分期增加有關，高表達miR-205的宮頸癌患者總體生存率較低，是預測宮頸癌預后的生物標志物。另有研究表明，分析miRNA表達及其相關靶基因，為了解宮頸癌的發病機制和預后提供了有效的生物學信息，并可作為宮頸癌高危人群早期篩查和早期診斷的生物學標志物[17]。

綜上所述，宮頸癌患者血清miR-205與miR-944表達水平明顯升高，且與臨床分期、浸潤深度及淋巴結轉移有關，有助于指導宮頸癌的早期診斷，兩項聯合檢測對指導宮頸癌的診斷具有較高價值。利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突