53株耐碳青霉烯類藥物粘質沙雷菌的耐藥表型分析

張燕 周萬青 李佳 鄭潔 高碩 張之烽 孟玲寧 曹小利 沈瀚 張葵

粘質沙雷菌作為醫(yī)院內(nèi)的重要致病菌，可造成住院患者發(fā)生肺炎、泌尿道感染、敗血癥以及外科手術感染。近年來隨著碳青霉烯類抗生素在臨床廣泛使用，耐碳青霉烯粘質沙雷菌的臨床分離率和耐藥率正逐步上升[1，2]，給臨床治療帶來很大困難。產(chǎn)碳青霉烯酶是細菌耐碳青霉烯類藥物的主要耐藥機制[3]。本文調查分析本院粘質沙雷菌的耐藥情況，并對其耐碳青霉烯類藥物的可能機制進行探討，為臨床抗感染治療提供一定依據(jù)。

材料與方法

1 菌株來源 收集南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院2018年6月～2019年9月臨床分離的非重復粘質沙雷菌235株。所有菌株經(jīng)Vitek 2 Compact及配套GN鑒定和GN13卡檢測藥物敏感性。篩選出同時對美羅培南和亞胺培南耐藥菌株53株，樣本分布包括痰液48株（90.7%）、血液3株（5.7%）、分泌物1株（1.8%）、胸水1株（1.8%）。科室分布為神經(jīng)外科31株（58.5%）、ICU 12株（22.6%）、急診病區(qū)7株（13.2%）、呼吸內(nèi)科2株（3.8%）和老年科1株（1.9%）。大腸埃希菌（ATCC25922）、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-2146為本實驗室保存菌株。

2 主要儀器及試劑 Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定分析儀及配套GN和GN13板卡、MALDI-TOFMS基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（法國梅里埃生物公司）；2720型PCR擴增儀（Applied Biosystems公司）；電泳儀及GelDoc XR型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；血平板和MH平板（賽默飛公司）；藥敏紙片（Oxoid）；胰蛋白酶大豆肉湯（青島海博生物技術公司）、EDTA（上海生工）；2×Taq Mix（DBI公司）；PCR引物合成及序列測定由上海生工公司合成；瓊脂糖干粉（法國Biowest公司）；100 bp DNA Marker（大連Takara公司）。

3 細菌鑒定與藥敏試驗 使用Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定分析儀配套GN板卡鑒定菌株，并用MALDI-TOF-MS基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀復核菌株。使用Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定分析儀配套GN13板卡檢測藥物敏感性，同時使用紙片擴散法進行復核。依據(jù)CLSI M1002019版判定標準進行結果判讀[4]。

4 碳青霉烯酶表型篩選 改良碳青霉烯酶滅活試驗（mCIM）：依據(jù)CLSI M1002019[4]，用1 μL接種環(huán)取血平板上過夜培養(yǎng)的菌落加入2 mL胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）中乳化。渦旋震蕩10～15 s。將10 μg美羅培南紙片加到每個細菌懸液管中，確保整個紙片浸沒在懸液中，35℃孵育4 h。用10 μL接種環(huán)撈出美羅培南紙片并瀝干多余液體，將其貼在已涂布0.5麥氏單位的大腸埃希菌ATCC25922的MH平板上。35 ℃孵育18～24 h，量取抑菌圈直徑。結果判定：①碳青霉烯酶陽性：抑菌圈直徑6～15 mm或在16～18 mm抑菌圈內(nèi)有針尖狀菌落；②碳青霉烯酶陰性：抑菌圈直徑≥19 mm；③碳青霉烯酶不確定：抑菌圈直徑16～18 mm或者抑菌圈直徑≥19 mm但抑菌圈內(nèi)有針尖狀菌落。肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705和ATCC BAA-1706分別作為陽性和陰性質控菌株，同時做空白對照。EDTA-改良碳青霉烯酶滅活試驗（eCIM）：標記另一支2 mL胰蛋白酶大豆肉湯（TSB），加入20 μL 0.5 mol/L EDTA溶液；余下步驟同上述mCIM步驟。結果判定：mCIM試驗陽性為前提；①金屬-β-內(nèi)酰胺酶陽性：eCIM與mCIM結果相比較，美羅培南抑菌圈直徑相差≥5 mm；②金屬-β-內(nèi)酰胺酶陰性：eCIM與mCIM結果相比較，美羅培南抑菌圈直徑相差≤4 mm。對于eCIM，任何抑菌圈內(nèi)的針尖狀菌落均忽略不計。肺炎克雷伯菌ATCC BAA-2146和ATCC BAA-1706分別作為陽性和陰性質控菌株，同時做空白對照。

5 細菌DNA模板提取 挑取血平板過夜培養(yǎng)的菌落2～3個，于250 μL無菌水中研磨混勻后，金屬浴加熱煮沸15 min，12000 r/min 離心5 min，將上清液轉移至無菌微量離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6 耐藥基因PCR與測序 參照文獻[5]合成碳青霉烯酶基因引物，見表1。反應體系20 μL：2×Taq 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板2 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應條件根據(jù)不同的碳青霉烯酶基因略有差異。配制10 g/L瓊脂糖凝膠，對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并保存圖片。委托生工生物工程有限公司進行PCR擴增產(chǎn)物測序，基因序列經(jīng)NCBI網(wǎng)站BLAST程序進行比對。

7 統(tǒng)計學處理 應用WHONET 5.6軟件對MIC藥敏結果、K-B法的藥敏結果進行統(tǒng)計分析。

表1 PCR引物序列及擴增片段長度

結 果

1 藥敏結果 235株粘質沙雷菌對亞胺培南的耐藥率為25.6%，對頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢曲松、氨曲南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率分別為35.1%、35.3%、31.2%、36.2%、31.6%。對阿米卡星、復方新諾明的耐藥率分別為1.0%、3.2%，見表2。其中檢出同時對美羅培南和亞胺培南耐藥粘質沙雷菌53株，其對頭孢曲松、氨曲南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率均大于98%，對阿米卡星、復方新諾明的耐藥率分別為1.7%、1.6%，對美羅培南均耐藥，見表3。

表2 235株粘質沙雷菌對常見藥物耐藥情況

表3 53株耐碳青酶烯粘質沙雷菌對常見藥物耐藥情況

2 碳青霉烯酶表型篩選結果 53株待測菌株mCIM全部陽性；eCIM陽性3株。

3 PCR檢測碳青霉烯酶基因結果 53株菌株中檢出blaKPC基因51株，檢出blaNDM基因1株，1株同時攜帶blaKPC和blaNDM基因。53株均未檢出攜帶blaIMI、blaOXA48、blaFOX、blaIMP、blaVIM基因。經(jīng)測序，blaKPC基因均為blaKPC-2基因，blaNDM基因均為blaNDM-1。基因分布情況見表4。部分blaKPC基因擴增產(chǎn)物凝膠成像圖見圖1，部分blaKPC基因擴增產(chǎn)物測序圖見圖2。

表4 53株耐碳青酶烯粘質沙雷菌耐藥基因分布

圖1 部分blaKPC基因擴增產(chǎn)物凝膠成像圖

圖2 部分blaKPC基因擴增產(chǎn)物測序圖

討 論

本調查顯示，粘質沙雷菌已經(jīng)成為呼吸道感染的主要病原菌，特別在神經(jīng)外科和重癥監(jiān)護室。碳青霉烯類抗生素是目前治療多重耐藥革蘭陰性桿菌的一線藥物，隨著抗菌藥物廣泛應用，碳青霉烯類耐藥菌株的檢出不斷增多，形勢嚴峻[6]。本院調研期間檢出的235株粘質沙雷菌對亞胺培南的耐藥率為25.6%，對頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢曲松、氨曲南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率均在30%以上。對阿米卡星、復方新諾明的耐藥率分別為1%和3.2%。與相關文獻報道[7]相比，本院耐碳青霉烯粘質沙雷菌的檢出率相對較高，對頭孢曲松、氨曲南、喹諾酮類藥物的耐藥率也明顯高于文獻報道。

所分離的53株耐碳青霉烯粘質沙雷菌的科室分布以神經(jīng)外科為主，這可能與患者進行侵入性手術以及長時間大劑量使用抗生素有關。分離出耐藥菌株的樣本以痰液為主，由此可見，粘質沙雷菌的感染主要以呼吸系統(tǒng)感染為主[8]。藥敏結果顯示對頭孢曲松、氨曲南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率均大于98%，對阿米卡星、復方新諾明的耐藥率分別為1.7%、1.6%，提示在此類細菌感染時可選的抗生素種類有限；對頭孢他啶的耐藥率為17%，敏感率為43.4%，這與袁園等的報道[9]不符，具體的機制尚待進一步研究。

粘質沙雷菌對碳青霉烯類耐藥的主要機制是產(chǎn)生碳青霉烯酶[10]。依據(jù)Ambler分子分類，可分為A、B、D三大類。A類主要包括NMC、IMI、SME、KPC、GES等，在體外可以被克拉維酸和他唑巴坦抑制水解活性；B類主要包括NDM、IMP、VIM、GIM、SPM等，可以被EDTA等金屬離子整合劑抑制，故B類又稱金屬酶；D類又稱OXA酶，不能被酶抑制劑和EDTA 抑制，對碳青霉烯類藥物的水解活性較弱。通過碳青霉烯酶表型檢測發(fā)現(xiàn)，53株碳青霉烯類耐藥粘質沙雷菌mCIM試驗均陽性，eCIM試驗僅3例陽性。進一步基因檢測發(fā)現(xiàn)，53株菌株均檢出碳青霉烯酶基因，其中51株攜帶blaKPC-2基因，1株攜帶blaNDM-1基因, 1株同時攜帶blaKPC-2和blaNDM-1基因。由此可見，mCIM試驗對KPC酶的敏感性較高；而對于3株eCIM試驗陽性菌株，2株攜帶blaNDM-1基因，另1株可能攜帶其他B類碳青霉烯酶基因。由此可見，blaKPC-2基因是介導本院粘質沙雷菌對碳青霉烯類藥物耐藥的主要流行基因型，與文獻報道一致[11]。

綜上所述，本院耐碳青霉烯粘質沙雷菌的檢出率較高，blaKPC-2基因是介導本院粘質沙雷菌對碳青霉烯類藥物耐藥的主要流行基因型，應引起臨床重視，注意謹慎、合理、規(guī)范地使用抗菌藥物，從而控制耐藥性的播散，做好院內(nèi)感染防控。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突