三種試劑對紅細胞表面CD38抗原去除效果的研究

邵林楠 張樹婷 王霓 周世航 于衛建

多發性骨髓瘤（MM）是一種漿細胞克隆性增殖的血液系統惡性腫瘤，發病率占血液系統腫瘤的10%左右[1]。在骨髓瘤細胞表面CD38抗原高表達，然而在紅細胞、正常淋巴細胞和骨髓細胞上表達相對較弱，因此CD38分子已作為治療MM的新靶點[2]。當MM患者通過抗-CD38單抗達雷妥尤（Daratumumab）治療時，達雷妥尤單抗與紅細胞表面CD38抗原結合，會造成患者血清（血漿）與幾乎所有人紅細胞間接抗人球蛋白試驗（IAT）均弱陽性的結果[3]。CHAPUY等[3]使用0.2 mol/L二硫蘇糖醇（DTT）破壞紅細胞表面CD38抗原，從而使這種干擾現象得到緩解，而使用1%胰蛋白酶法得到的結果稍遜色于DTT法。此外CHAPUY等推測使用二巰基乙醇（2-ME）同樣能達到緩解達雷妥尤帶來的干擾[4]，但未經證實。由于我國實驗室常用2-ME試劑，而且處理紅細胞用的酶試劑多為菠蘿蛋白酶及木瓜蛋白酶，胰蛋白酶相對使用較少[5]。因此結合國內實驗室情況，本文我們參照CHAPUY等[3]報道的試劑濃度，研究了0.2 mol/L DTT、0.2 mol/L 2-ME及1%菠蘿蛋白酶對紅細胞表面CD38抗原去除的效果。

材料與方法

1 研究對象 血漿取自經達雷妥尤單抗治療的MM患者（意外抗體篩查陽性，抗體特異性為IgM性質抗-Leb）；選取Leb抗原陰性的譜細胞及Leb抗原陰性的O型獻血者紅細胞各3份配成2%懸液。

2 試劑與儀器 抗人球蛋白試劑（抗IgG）購自上海血液生物醫藥公司；2-ME購自長春博德生物科技有限公司；抗-Leb購自CE-IMMUNDIAGNOSTIKA GmbH公司；抗-E購自上海血液生物醫藥公司；DTT購自美國Promega公司；菠蘿蛋白酶購自美國Sigma公司；譜細胞購自Sanquin公司；KA-2200型離心機（日本久保田公司）；DK-600A型水浴箱（上海一恒儀器公司）。

3 試驗方法 0.2 mol/L DTT配制方法參照CHAPUY[4]等。0.2 mol/L 2-ME和1%菠蘿蛋白酶配制方法參照《輸血技術學》[5]。紅細胞處理方法參照文獻[4]：上述溶液與紅細胞懸液按照體積比4∶1混合，于37℃孵育30 min，生理鹽水洗滌三次后配制成試驗用紅細胞懸液。同時采用未經處理的Leb抗原陰性的譜細胞及Leb抗原陰性的O型獻血者紅細胞懸液各3份作為對照。通常使用K+和E+紅細胞作為巰基試劑處理的對照細胞，其中K抗原可被巰基試劑破壞，而E抗原不會被破壞[4]。由于無法獲得抗-K血清，本實驗中僅用E+紅細胞作為對照。將紅細胞懸液與含有達雷妥尤單抗的患者血漿進行間接抗球蛋白實驗（IAT）[5]，來評估去除CD38抗原的效果。凝集判斷標準參照《輸血技術學》[5]。

結 果

1 DTT、2-ME及菠蘿蛋白酶對紅細胞表面E抗原處理結果 經0.2 mol/L DTT和0.2 mol/L 2-ME處理過的E+對照紅細胞，使用直接離心法對紅細胞表面E抗原進行檢測，凝集強度仍為4+，與處理前凝集強度無差異。同樣的，經過1%菠蘿蛋白酶處理過的E+對照紅細胞，E抗原也與處理前無差異（凝集強度4+）。

2 患者血漿與DTT、2-ME及菠蘿蛋白酶處理后紅細胞間接抗人球蛋白試驗結果經0.2 mol/L DTT、0.2 mol/L 2-ME及1%菠蘿蛋白酶處理過的紅細胞與患者血漿進行IAT，結果見表1。

表1 患者血漿與備用紅細胞懸液進行間接抗人球蛋白試驗結果

由2-ME處理過的紅細胞IAT結果均為陰性，DTT處理過的紅細胞IAT結果1例獻血者紅細胞發生溶血，其余5例細胞結果均為陰性，而菠蘿蛋白酶處理的紅細胞進行IAT過程中有3例發生溶血現象，而余下3例IAT結果為顯微鏡下弱陽性。陽性對照結果為1+。

在進行IAT期間發現，經過DTT、2-ME及菠蘿蛋白酶三種試劑處理過的紅細胞均發生不同程度的溶血現象，最嚴重的為1%菠蘿蛋白酶處理過的紅細胞，6例紅細胞中的3例發生完全溶血現象（見圖1）。

圖1 IAT實驗過程中，三種試劑處理過的紅細胞經過三次洗滌后剩余紅細胞示意圖

討 論

2019年7月，用于治療復發難治性M M的抗-CD38單克隆抗體達雷妥尤在我國批準上市。隨著達雷妥尤單抗治療的日益普及，輸血實驗室接收到此類患者血液標本的可能性也隨之增加。由于達雷妥尤單抗對IAT產生泛凝集干擾，將為輸血服務帶來重大挑戰。2016年美國血庫協會（AABB）曾發布公告，介紹使用DTT處理紅細胞表面CD38抗原進而消除干擾的方法。

DTT和2-ME是巰基還原劑，可以通過破壞紅細胞胞外區的二硫鍵，進而使紅細胞表面CD38抗原變性，阻止抗-CD38與紅細胞結合[4]；而酶處理的作用是切割紅細胞表面CD38抗原[6]。本文通過對比三種試劑對獻血者新鮮紅細胞、試劑紅細胞表面CD38抗原的去除效果，發現三種試劑均能去除紅細胞表面CD38抗原，獻血者的新鮮紅細胞和試劑紅細胞之間區別不大。CHAPUY等[3]通過實驗發現2%胰蛋白酶可將達雷妥尤與CD38抗原陽性HL-60細胞的結合率降低40%，而使用10 mmol/L DTT則可使結合率降低92%，說明DTT去除CD38抗原的效果要優于酶處理法，本文的試驗結果與這一報道相一致。由于在實驗過程中1%菠蘿蛋白酶處理過的紅細胞溶血最為嚴重，因此不建議使用菠蘿蛋白酶試劑處理紅細胞去除CD38抗原。目前國外通常采用0.2 mmol/L DTT處理紅細胞來解決達雷妥尤的干擾，本文結果顯示0.2 mmol/L DTT與0.2 mmol/L 2-ME去除紅細胞表面CD38抗原效果基本一致，無DTT試劑時可以用2-ME替代。本文中三種試劑處理紅細胞后，雖然紅細胞表面CD38抗原得到破壞，但是同時使紅細胞變得脆弱，相對于未經處理的紅細胞更容易發生溶血現象。但溶血現象也與實驗過程中操作有關，如洗滌時生理鹽水對紅細胞的沖擊力過強、重懸紅細胞時震蕩過于猛烈等。如果使用微柱凝膠卡法，可以有效規避上述手工操作對處理紅細胞造成的不良影響。

HUGAN等[7]報道0.2 mol/L DTT處理的譜細胞，在12 d內雖然會發生溶血現象但不影響檢測性能，但溶血可能導致DTT處理的譜細胞數量減少。而LALLY等[8]研究發現，經DTT處理的篩選細胞，在9天內可檢測到細胞表面具有臨床意義的抗原（Kell除外），但對于某些同種抗體的反應強度卻降低了一到兩個等級。LORENZEN等[9]對DTT處理方法進行了改良，按照紅細胞與0.2 mol/L DTT體積比為30∶25的比例處理紅細胞，經處理紅細胞與未經處理紅細胞的溶血程度相同，而且可以保存33 d，此期間內反應強度沒有下降。此外應該注意的是，DTT是有刺激性氣味的有害物質，部分試驗應該在通風柜下操作[5]。

DTT處理紅細胞可解決達雷妥尤干擾，但是此類含巰基試劑處理存在一些不足：首先會對紅細胞造成破壞，導致后續試驗中紅細胞更加容易溶血。其次在破壞CD38抗原的同時也會使Kell、Yt、JMH、Cartwright（Yta）、Scianna、Lutheran、LW、Cromer、Indian、Dombrock、Knops、Some Diego、MER2、Ge3等抗原變性或減弱[10]，在抗體鑒定、篩查或交叉配血試驗中存在漏檢抗體的風險。

本文的不足之處是只評估了三種試劑的一種工作濃度對紅細胞表面CD38抗原的清除能力，這是因為受限于患者剩余血漿量。今后在條件允許的情況下，將會使用微柱凝膠卡法進一步評估三種試劑不同濃度對CD38抗原的處理效果。綜上所述，三種試劑均能去除紅細胞表面CD38抗原，但0.2 mol/L DTT、0.2 mol/L 2-ME去除效果優于1%菠蘿蛋白酶，而且0.2 mol/L 2-ME可以作為0.2 mol/L DTT的替代品使用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突