抗-D抗體的定量測(cè)定與效價(jià)測(cè)定的比較性研究*

趙俸涌 楊啟修 郭忠慧 張嘉敏 李勤 沈偉 葉璐夷 朱自嚴(yán) 向東

Rh系統(tǒng)血型同種抗體是造成嚴(yán)重新生兒溶血疾病的主要原因[1，2]，IgG抗-D抗體定量?jī)x已被歐洲、北美及澳大利亞廣泛使用，它主要用來(lái)對(duì)RhD陰性孕婦血漿中的抗-D抗體進(jìn)行監(jiān)測(cè)，同時(shí)也用于CCee表型的孕婦及患者抗-c抗體的檢測(cè)；除此之外，它還應(yīng)用于抗-D免疫球蛋白注射后RhD陰性母親血漿中的抗-D免疫球蛋白殘余量的檢測(cè)[3-8]。我國(guó)目前尚未在臨床上開(kāi)展抗-D免疫球蛋白預(yù)防RhD血型不匹配導(dǎo)致的胎母免疫，亦沒(méi)有開(kāi)展抗-D抗體定量實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室通常對(duì)產(chǎn)生抗-D抗體的孕婦及患者血清使用效價(jià)測(cè)定的方法進(jìn)行檢測(cè)和記錄，并作為評(píng)估指標(biāo)[9-11]。而采用效價(jià)測(cè)定作為抗體評(píng)價(jià)的方法是否與抗體定量值相關(guān)，目前我國(guó)還未有相關(guān)研究。為了未來(lái)在臨床上科學(xué)開(kāi)展血型抗體引發(fā)新生兒溶血病的免疫性預(yù)防及監(jiān)測(cè)工作，也為了研究采用抗體效價(jià)測(cè)定作為治療評(píng)判的科學(xué)性，我們對(duì)IgG抗-D抗體量與效價(jià)的關(guān)系進(jìn)行了一些研究。

材料與方法

1 試劑與儀器 抗-A，抗-B定型單克隆抗體試劑盒（批號(hào)：20181023）及A、B、O細(xì)胞試劑盒（批號(hào)：20195364）用于ABO定型，IgM抗-C（批號(hào)：20183001）、IgM抗-E（批號(hào)：20183201）、IgM抗-c（批號(hào)：20183101）、IgM抗-e（批號(hào)：20183301）用于Rh系統(tǒng)抗原表型分型（以上血型檢測(cè)試劑均來(lái)自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）。4人份O型CCDee表型的細(xì)胞（R1R1）作為試劑細(xì)胞用于效價(jià)和抗體定量實(shí)驗(yàn)，抗體效價(jià)測(cè)定采用ORTHOVISION自動(dòng)血型檢測(cè)儀及配套抗人球凝膠卡（Ortho，美國(guó)，批號(hào)：IGC051H）進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)。IgG抗-D國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（NIBSC code：73/517）用于制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，抗-D質(zhì)控品（QC）血漿（人源性抗-D，上海市血液中心血型參比室自制）用于QC監(jiān)測(cè)。O型外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)板（FALCON，批號(hào)：354108）培養(yǎng)，用于單核細(xì)胞單層吞噬試驗(yàn)（MMA），使用顯微鏡觀察結(jié)果。

2 樣本制備 本實(shí)驗(yàn)選擇了送至上海市血液中心血型參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)的樣本中17份抗-D效價(jià)大于64的孕婦及產(chǎn)生抗-D抗體患者的血漿樣本（見(jiàn)表1），用于效價(jià)測(cè)定及抗體定量實(shí)驗(yàn)。血漿樣本2500 g離心5 min，取上清。所有血漿樣本均使用譜細(xì)胞進(jìn)行鹽水法檢測(cè)以排除IgM抗體，并通過(guò)抗體鑒定排除抗-D以外的意外抗體干擾。

3 抗體定量檢測(cè)與抗體效價(jià)檢測(cè) 將抗-D國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品按照10個(gè)濃度梯度進(jìn)行稀釋并制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，QC-血漿按照比例稀釋用于QC監(jiān)測(cè)，每10個(gè)樣品進(jìn)行一次QC驗(yàn)證。將待檢血漿按照相應(yīng)濃度，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行稀釋?zhuān)_保所有樣本按不同稀釋度稀釋后，抗體濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)（表1）。抗體效價(jià)測(cè)定采用ORTHOVISION自動(dòng)血型檢測(cè)儀及抗人球蛋白凝膠卡進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)。對(duì)全部樣本進(jìn)行抗體效價(jià)與抗體定量相關(guān)性分析，對(duì)例數(shù)大于等于3的256（n=4）、512（n=3）、2048（n=3）三個(gè)效價(jià)組中每個(gè)樣本都對(duì)效價(jià)和抗體定量（IU/Titer）進(jìn)行了比較（其中，128效價(jià)組由于其中一例樣本存在蛋白析出，為保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性，并未對(duì)128效價(jià)組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)）。

表1 抗-D抗血漿效價(jià)

4 單核細(xì)胞單層試驗(yàn)（Monocyte Monolayer Assay,MMA） 對(duì)256組4份樣品進(jìn)行MMA檢測(cè)，評(píng)估抗體介導(dǎo)紅細(xì)胞被免疫吞噬的能力。將PBMC分離后，鋪板培養(yǎng)2 h，待單層細(xì)胞貼壁后，加入已使用抗血清致敏的紅細(xì)胞（含有IgG抗-D的血漿稀釋10倍后與紅細(xì)胞于37℃共同孵育30 min后使用鹽水洗滌3次）懸液，進(jìn)行吞噬，30 min后固定染色，顯微鏡觀察結(jié)果，選取10個(gè)視野統(tǒng)計(jì)吞噬率，并求平均數(shù)。采用10 IU IgG抗-D國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)血漿致敏的紅細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，采用新鮮AB型抗篩陰性血漿作為陰性對(duì)照。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 抗體定量檢測(cè) 所有試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線r值大于0.99，C V值在±S D范圍區(qū)間內(nèi)，含抗-D抗體血漿為（0.006-0.092）IU/Titer（定量值/效價(jià)），效價(jià)與國(guó)際單位間相關(guān)系數(shù)r=0.92；P＜0.001（圖1A）。

2 不同效價(jià)組抗體定量值比較 256組（0.029±0.002）IU/Titer；512組（0.072±0.027）IU/Titer；2048組（0.038±0.015）IU/Titer，256組與512組比較P＜0.001；512組與2048組比較P=0.215，256組和2048組P=0.102（圖1B）。抗體定量試驗(yàn)絕對(duì)檢測(cè)范圍為：0.005 IU/mL～0.033 IU/mL，實(shí)驗(yàn)樣本定量值=實(shí)際檢測(cè)值×稀釋倍數(shù)。

3 265效價(jià)組抗體介導(dǎo)吞噬試驗(yàn) 單核細(xì)胞單層吞噬實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)雖然抗體效價(jià)都為256，但其導(dǎo)致的吞噬率并不一致（分別為4.2%，8%，15%，9%）其中一例吞噬率明顯高于其他三例（圖2）。該組四例標(biāo)本抗體定量值見(jiàn)表2。

圖1 抗體效價(jià)法與抗體定量法檢測(cè)比較

圖2 256效價(jià)組血漿抗體介導(dǎo)紅細(xì)胞免疫吞噬

表2 256效價(jià)組測(cè)定結(jié)果

討 論

目前發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)采用抗體定量法對(duì)RhD陰性孕婦進(jìn)行抗-D抗體監(jiān)測(cè)以評(píng)估由抗-D介導(dǎo)的胎兒及新生兒溶血性疾病，從而進(jìn)行必要的干預(yù)治療；同時(shí)，抗體定量法還可以用于對(duì)抗-D免疫球蛋白預(yù)防性注射后母體外周血?dú)堄嗫贵w的量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而確保預(yù)防效果。而國(guó)內(nèi)主要采用效價(jià)測(cè)定的方法，對(duì)母體血漿抗-D抗體進(jìn)行監(jiān)測(cè)，預(yù)測(cè)胎兒及新生兒發(fā)生溶血性疾病的嚴(yán)重程度[3-8]。

抗-D連續(xù)流自動(dòng)抗體檢測(cè)儀主要工作原理是利用抗體對(duì)酶處理細(xì)胞發(fā)生凝集這一現(xiàn)象，在去除凝集塊后將殘余紅細(xì)胞進(jìn)行破膜，最后檢測(cè)其游離血紅蛋白的含量，并經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，獲得其對(duì)應(yīng)的國(guó)際單位值。而效價(jià)方法則是通過(guò)稀釋抗體后觀察與紅細(xì)胞凝集程度。在放開(kāi)二胎的新形勢(shì)下，由于抗-D引起的新生兒溶血病具有首次懷孕誘發(fā)母體免疫并作用于再次懷孕的特性，勢(shì)必導(dǎo)致該疾病發(fā)生概率的增加，而抗-D免疫球蛋白預(yù)防性治療被認(rèn)為是最有效的方法[6-8]。抗-D免疫球蛋白是根據(jù)母體內(nèi)胎兒紅細(xì)胞量估算而進(jìn)行注射的，由于通常注射后被動(dòng)獲得的抗-D抗體很少能達(dá)到4以上的效價(jià)，且抗體效價(jià)與RhIG的有效性或胎兒母體出血（Fetomaternal hemorrhage，F(xiàn)MH）的量無(wú)關(guān)。因此，采用定量法對(duì)預(yù)防性抗-D免疫球蛋白注射后抗體的監(jiān)測(cè)比抗體定量方法更為準(zhǔn)確[12]。在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，抗體普遍經(jīng)過(guò)500～20000倍稀釋后進(jìn)行連續(xù)流檢測(cè)（表1），而在該稀釋度下，無(wú)法進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)。一般經(jīng)抗-D免疫球蛋白注射后，體內(nèi)含量為1500 IU（約0.33 IU/mL），如若對(duì)注射后殘留抗體進(jìn)行檢測(cè)，用效價(jià)方法在檢測(cè)精度和準(zhǔn)確性方面都存在著不足。

本研究在對(duì)不同效價(jià)抗體組血漿的單位效價(jià)抗體定量（IU/Titer）比較后發(fā)現(xiàn)，512組IU/Titer比256組與2048組高出接近兩倍，說(shuō)明效價(jià)方法與抗體定量值存在不平行，某些樣本存在顯著差異。同時(shí)，在對(duì)256組進(jìn)行MMA試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)同一效價(jià)組抗體介導(dǎo)紅細(xì)胞被免疫清除的能力也存在較大差異，該結(jié)果也說(shuō)明，效價(jià)測(cè)定方法對(duì)胎兒或新生兒溶血反應(yīng)預(yù)測(cè)作用并不準(zhǔn)確[13，14]。在對(duì)256組進(jìn)行抗體定量后，發(fā)現(xiàn)定量值高低與吞噬強(qiáng)弱相關(guān)一致性較好，較高定量值的抗體吞噬程度較強(qiáng)（圖2、表2）也說(shuō)明抗體定量方法較效價(jià)方法對(duì)紅細(xì)胞免疫清除強(qiáng)度的預(yù)測(cè)更有效；但我們也發(fā)現(xiàn)，在如256-3與256-4相比較，二者定量值比與吞噬率比而言存在差異，這可能是由于兩份樣本IgG亞型和比例不同造成的[12]，這也是本研究團(tuán)隊(duì)下一步開(kāi)展研究的方向。

綜上，在本研究中發(fā)現(xiàn)，雖然大部分抗體的高效價(jià)意味著抗體定量值較高，但仍然有相當(dāng)一部分高效價(jià)的抗體定量值很低，并且在不同效價(jià)組間，抗體的IU/Titer比存在顯著差異，可能的原因是不同個(gè)體及不同效價(jià)抗體的親和力不同，而依據(jù)親和力方程，顯然親和力更高的抗體會(huì)更易于和紅細(xì)胞形成穩(wěn)定的結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致紅細(xì)胞被清除，最終造成溶血。而抗體定量?jī)x實(shí)驗(yàn)過(guò)程中恰恰包含了親和力因素。因此，抗體定量在抗-D抗體的監(jiān)測(cè)方面比效價(jià)方法存在更多優(yōu)勢(shì)。

當(dāng)然，本研究存還在一些不足，如產(chǎn)生抗-D抗體血漿的樣品數(shù)限制，僅進(jìn)行了較小樣本量的探索性實(shí)驗(yàn)。在后期的延續(xù)性研究中，還應(yīng)該對(duì)更多的樣本進(jìn)行檢測(cè)，以獲得更為精確的結(jié)果。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突