1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶p.Arg187Cys突變導(dǎo)致形成ABx亞型*

曾一梅 雷航 王鈺箐 龔淞頌 王學(xué)鋒 蔡曉紅 鄒緯

1900年發(fā)現(xiàn)的人類第一個(gè)血型系統(tǒng)——ABO血型系統(tǒng)，被認(rèn)為是輸血醫(yī)學(xué)及組織移植中最重要的血型系統(tǒng)[1-3]。ABO基因包含7個(gè)外顯子，主要編碼兩種不同的糖基轉(zhuǎn)移酶，1,3-N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶（A糖基轉(zhuǎn)移酶，GTA）和1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（B糖基轉(zhuǎn)移酶，GTB）[4，5]。ABO基因多態(tài)性或突變可導(dǎo)致酶活性或特異性改變而影響ABO表型[6],從而引起ABO血型血清學(xué)鑒定中正反定型不一致，定型和配血困難。既往在中國人群中發(fā)現(xiàn)的1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶p.Arg187Cys突變個(gè)體表型為正常B型[7]。本研究探究該突變導(dǎo)致ABO血型正反定型不符和AB亞型的可能分子機(jī)制。

對象與方法

1 標(biāo)本來源 健康中國籍個(gè)體，男性，漢族，ABO血型鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)正反定型不符。使用EDTA-K2抗凝管采集外周靜脈血5 mL進(jìn)行血清學(xué)和分子生物學(xué)方法檢測。

2 方法

2.1 檢測試劑：單克隆抗-A和抗-B、抗-A1血清、抗-H血清和ABO反定型紅細(xì)胞和篩選紅細(xì)胞（均購自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；血液基因組DNA提取試劑盒（天根生物產(chǎn)品）。DNA瓊脂糖凝膠純化試劑盒（GeneMark產(chǎn)品）。

2.2 血型血清學(xué)檢測：ABO正反定型和抗體篩查使用Galileo全自動(dòng)血型分析儀（Immucor公司，美國）進(jìn)行初次檢測。采用試管法進(jìn)行ABO血型復(fù)檢，參照國際公認(rèn)的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作方法進(jìn)行[8]。血清學(xué)亞型分類標(biāo)準(zhǔn)按文獻(xiàn)判斷[9]。

2.3 基因組DNA的提取和擴(kuò)增：采用天根生物血液基因組DNA提取試劑盒，嚴(yán)格按照說明書提取患者外周血基因組DNA。對ABO基因的增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和所有7個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增引物、擴(kuò)增條件根據(jù)參考文獻(xiàn)[10，11]設(shè)計(jì)，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，見表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃3 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃60 s共30個(gè)循環(huán)；后置72℃延伸8 min。

表1 用于擴(kuò)增和測序ABO基因片段的引物

2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序：利用DNA瓊脂糖凝膠純化試劑盒（GeneMark產(chǎn)品）嚴(yán)格按照試劑說明書純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物, 委托上海生工生物技術(shù)有限公司對純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序和克隆后測序分析。

2.5 突變對GTB蛋白結(jié)構(gòu)影響的預(yù)測：對ABO*B基因突變c.559C＞T導(dǎo)致的1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶突變GTB-R187C進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。GTB以人類1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的晶體（PDB ID：2RJ8）結(jié)構(gòu)為分子模型，采用Chimera軟件（版本1.1University of California,SanFrancisco，CA）進(jìn)行突變體構(gòu)建，并對突變后的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[12]。GTA蛋白3D結(jié)構(gòu)圖的繪制采用PyMol軟件[DeLano,W.L.the Py MOLMolecular Graphics System（2003-2011），版本1.4.1，De Lano Scientific,San Carlos，CA]。

2.6 突變與等位基因命名法：根據(jù)國際輸血協(xié)會(huì)（ISBT）的命名方式對突變和ABO等位基因進(jìn)行命名。

結(jié) 果

1 血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ABO正定型時(shí),與單克隆抗-A、抗-B、抗-A1和人源抗-A強(qiáng)凝集4+,與人源抗-B反應(yīng)2+，與抗-H反應(yīng)為1+（抗-H與Bc反應(yīng)1+，與Oc反應(yīng)2+）；反定型時(shí)血漿與標(biāo)準(zhǔn)A細(xì)胞和O細(xì)胞不凝集，與標(biāo)準(zhǔn)B細(xì)胞和兩份新鮮B細(xì)胞弱凝集。血清學(xué)表現(xiàn)為正反不符，不規(guī)則抗體篩查未見異常，疑似ABx亞型，見表2。

2 PCR純化產(chǎn)物直接測序和克隆后測序分析 對該個(gè)體進(jìn)行ABO基因擴(kuò)增與測序顯示，該個(gè)體ABO基因第7外顯子在第559位堿基存在C＞T雜合突變（見圖1），該突變導(dǎo)致精氨酸被半胱氨酸替換。克隆后測序結(jié)果顯示，該突變位于B等位基因上。檢索ISBT血型抗原等位基因數(shù)據(jù)庫顯示存在c.559C＞T（p.Arg187Cys）突變的等位基因?yàn)锳BO*B.03等位基因。

表2 血清學(xué)及基因測序結(jié)果

圖1 標(biāo)本PCR測序結(jié)果

3 對GTB空間模型的分析 從3D結(jié)構(gòu)模型分析可看出，在野生型中，除Arg187的主鏈O和Met191的主鏈H形成氫鍵外，Arg187的側(cè)鏈H還與Gly176的主鏈O形成氫鍵（圖2B）；而在突變體R187C中，Cys187的主鏈O只與Met191的主鏈H形成氫鍵，不存在其他的氫鍵作用（圖2C）。說明R187C突變減弱了局部的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，可能因此導(dǎo)致酶活性下降。

圖2 野生型GTB和p.R187C突變體GTB的3D結(jié)構(gòu)比較

討 論

根據(jù)國際輸血協(xié)會(huì)（ISBT）的定義，我們通常所說的血型是指使用人類同種抗體檢測到的紅細(xì)胞上的表面抗原，它們是由基因所決定的一種遺傳性狀[13]。而ABO血型抗原的特異性是由紅細(xì)胞表面的ABH物質(zhì)的多糖鏈結(jié)構(gòu)決定的，是通過修飾多糖前體H物質(zhì)產(chǎn)生的。如果基因的改變降低了酶的活性或者改變其亞細(xì)胞位置[6]，從而減少H物質(zhì)到A或者B物質(zhì)的轉(zhuǎn)換，可能會(huì)導(dǎo)致弱A或B的亞型表現(xiàn)型。目前已知與ABO亞型有關(guān)的ABO基因突變有點(diǎn)突變、缺失、插入和基因重組等多種[14]。此外,某些ABO雜交酶可以導(dǎo)致同時(shí)合成多態(tài)性A和B抗原，從而產(chǎn)生所謂的cisAB或B（A）表型[6]。

該個(gè)體在血清學(xué)表型上疑似ABx，主要是通過反定型B細(xì)胞的凝集發(fā)現(xiàn)異常的。雖然正定型初篩時(shí)使用單克隆抗-B檢測到B抗原并未減弱，但是在復(fù)檢時(shí)使用人源抗-B檢測發(fā)現(xiàn)該個(gè)體的B抗原較正常表達(dá)B抗原的對照細(xì)胞有所減弱。綜合多份B細(xì)胞與待檢樣本血漿的反應(yīng)以及抗篩結(jié)果可以看出，血漿中存在不規(guī)則抗-B。本例H抗原未明顯增強(qiáng)，有研究發(fā)現(xiàn)AB型中如果B抗原為亞型而A抗原正常，則不會(huì)存在大量H抗原[15]。以上三個(gè)特征符合ABx表型的初步判斷。我們進(jìn)一步通過對血樣進(jìn)行ABO基因測序分析來確定ABO亞型。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其ABO基因B等位基因第559位堿基存在C＞T雜合突變，該突變導(dǎo)致187位精氨酸（Arg）被半胱氨酸（Cys）替換。Arg是堿性極性氨基酸，含有一個(gè)帶正電荷的胍基，傾向于結(jié)合供體尿苷二磷酸（UDP）的磷酸陰離子，對維持蛋白的總電荷平衡具有重要作用。而半胱氨酸是一個(gè)中性極性含巰基的氨基酸，側(cè)鏈較Arg短[16]。該突變使Cys187的主鏈O和Met191的主鏈H形成氫鍵外不存在其他的氫鍵作用，而在野生型中，除Arg187的主鏈O和Met191的主鏈H形成氫鍵外，Arg187的側(cè)鏈H還與Gly176的主鏈O形成氫鍵。說明R187C突變減弱了局部的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，可能因此導(dǎo)致酶活性下降。研究表明，氨基酸位點(diǎn)的改變會(huì)影響糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，進(jìn)而影響酶的活性或功能改變，從而造成ABO表型變?nèi)鮗17]。

值得注意的是，既往在中國人群中發(fā)現(xiàn)的1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶p.Arg187Cys突變個(gè)體表型為正常B型[7]，而我們發(fā)現(xiàn)的該個(gè)體在血清學(xué)表型為ABx。這很可能是由于該突變導(dǎo)致的1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性減弱較為輕微，在沒有1,3-N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶共同競爭底物H抗原的情況下，相應(yīng)紅細(xì)胞上B抗原量的減少也不明顯，導(dǎo)致采用高效價(jià)單克隆抗血清的常規(guī)定型時(shí)未見異常。而在AB型個(gè)體中，攜帶該突變的B基因與A基因共表達(dá)，在1,3-N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶的競爭作用下表現(xiàn)出弱B表型，而血清中產(chǎn)生了不規(guī)則的抗-B抗體，從而得以發(fā)現(xiàn)。通過對這一突變與ABO表型關(guān)聯(lián)性的分析我們可以看出，ABO基因的突變型與ABO表型的對應(yīng)關(guān)系并不完全一致，還需要結(jié)合個(gè)體的雙倍型等位基因的情況綜合考慮。

ABO血型不合的輸血可能引起急性血管內(nèi)溶血、腎功能衰竭甚至是死亡。同樣的，ABO血型不合的器官移植與急性體液排斥反應(yīng)相關(guān)[18]。因而血型鑒定結(jié)果的正確與否將直接影響到輸血和器官移植安全，利用分子生物學(xué)技術(shù)，不僅可以克服血型血清學(xué)方法的局限性[19]，也能進(jìn)一步了解其機(jī)制，為臨床安全用血和器官移植提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突