抗-D免疫球蛋白預防RhD血型不合胎兒新生兒溶血病的研究進展*

范秀 肖軍 李翠瑩

RhD母嬰血型不合新生兒溶血病（hemolytic disease of the fetus and newborn，HDFN）發生率僅次于ABO血型不合，但其病情重，并發癥風險高，出生前易致流產、死胎、胎兒水腫等，出生后易并發重度貧血、高膽紅素血癥、膽紅素腦病等，因此HDFN的預防愈顯重要。預防HDFN的策略包括：盡量避免胎兒紅細胞進入母體、降低母親致敏機會、減少母體抗體的產生和對產生抗體者設法中和抗體、防止抗原抗體結合等。目前認為最有效的預防方法是使用抗-D免疫球蛋白（anti-D immune globulin，抗-D Ig）防止母親致敏，現將其研究進展做一綜述。

1 抗-D免疫球蛋白預防HDFN的機制 應用抗-D Ig預防抗-D抗體引起的HDFN效果顯著，目前認為抗-D Ig預防HDFN的作用機制是抗體介導的免疫抑制機制（antibody-mediated immune suppression，AMIS）[1]。近一個世紀的研究中，基于不同機制的AMIS作用在不同的動物模型中不斷被發現，其中與抗-D Ig相關的機制主要有以下幾個方面。

1.1 紅細胞清除：在免疫系統識別前，抗-D Ig即能促進單核吞噬系統（尤其是巨噬細胞）吞噬和清除母體循環中的來源于胎兒的RhD抗原陽性紅細胞（RhD+紅細胞）[2]。在紅細胞表面結合的IgG與效應細胞表面IgG Fc段受體（FcγR）結合后引發吞噬作用中，抗-D Ig起到免疫調理作用（圖1）。雖然IgG還可通過促進紅細胞表面的補體激活，導致紅細胞溶解或補體受體介導的吞噬作用加速紅細胞清除，但抗-D Ig本身并不激活補體。這說明FcγR介導的吞噬作用可能是抗-D Ig引導的紅細胞清除的主要機制[3]。

圖1 抗-D Ig介導的RhD+紅細胞清除作用

1.2 表位封閉/空間位阻：在綿羊紅細胞（SRBC）免疫的小鼠模型研究中有大量證據表明，表位封閉/空間位阻可能在介導AMIS作用中起主要作用[4,5]。表位封閉/空間位阻假說認為IgG掩蔽抗原表位從而阻止抗原被特異性B細胞受體（BCR）識別[6]。當使用抗-D Ig時，抗-D Ig與RhD+ RBC結合后，能有效抑制RhD+ RBC被特異性B細胞識別，從而抑制免疫引起的溶血反應（圖2A）。

1.3 FcγRⅡB受體介導B細胞抑制：抗體Fc段受體（Fc gamma receptor，FcγR）屬于免疫球蛋白超家族，是一類與免疫球蛋白Fc段結合的主要表達于白細胞表面的糖蛋白，在功能上分為活化性受體和抑制性受體兩類。人類FcγR系統相對復雜，主要包括FcγRⅠ、FcγRⅡ和FcγRⅢ三個亞群，每個亞群又可分為多種亞型，同時存在多個異構體。活化性FcγR受體種類較多，如FcγRⅠA、FcγRⅡA和FcγRⅢA，主要通過偶聯含有免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM）的γ二聚體傳遞激活信號，介導免疫反應。在人體內抑制性FcγR只有一種，即Fc段受體ⅡB（Fc gamma receptor ⅡB，FcγRIIB），FcγRⅡB通過自身分子胞漿區的免疫受體酪氨酸基抑制基序（ITIM）傳遞抑制信號。人類FcγRⅡB 存在兩種主要異構體分子FcγRⅡB1和B2。FcγRⅡB1主要表達于B細胞表面，抑制B細胞激活、增殖、產生抗體；FcγRⅡB2主要由單核細胞和中性粒細胞表達，參與調節炎癥反應，具有較強的吞噬復合物功能，并調控細胞因子釋放。FcγRⅡB介導的B細胞抑制理論指出，抗-D Ig與紅細胞抗原形成免疫復合物時，抗體Fc段與其B細胞表面的受體結合，其中抑制性受體FcγRⅡB1與BCR交聯，該受體位于胞漿區的ITIM與BCR的ITAM近距離接觸時，該復合物傳遞抑制信號，進而以抗原特異性的方式抑制B細胞激活、增殖和產生抗體（圖2B）。

圖2 其他抗-D Ig介導的免疫抑制機制

1.4 抗-D免疫球蛋白糖基化：抗-D Ig介導人紅細胞的清除作用受FcγRⅢ多態性影響。除FcγRⅢ自身遺傳變異外，抗-D Ig每個Cγ2區域谷氨酰胺（Asn）297位點的N-糖基化修飾水平對抗-D Ig與Fc段受體（FcγR）的相互作用產生影響。去除Fc段糖成分后，抗-D Ig與Fc段受體間相互作用被抑制，這同時與補體激活及抗體依賴性細胞毒作用（ADCC）相關。抗-D Ig的多糖結構被認為在實現AMIS中發揮關鍵效能。由于抗-D Ig Fc段Asn297位點處的多糖僅能與FcγRⅢAsn162位點處的多糖產生相互作用，故抗-D Ig Fc段發生核心巖藻糖基化對抗-D Ig與FcγRⅢA和FcγRⅢB的結合有特異性影響，但對其他Fcγ受體無明顯作用。由于無核心巖藻糖基化抗體與FcγRⅢA結合能力明顯增強，故核心巖藻糖基化缺失顯著促進IgG介導的ADCC作用。而抗-D Ig的Fc段核心巖藻糖基化水平已被證明與HDFN嚴重程度相關，巖藻糖基化水平越低HDFN越嚴重。因此，認識抗-D Ig的Fc段糖基化修飾水平對于確定HDFN嚴重程度及了解疾病的潛在機制是至關重要的[7，8]。

1.5 其他假說：除上述免疫學機制外還有其他一些假說試圖解釋抗-D Ig作用的機理，如免疫漂移、細胞因子效應及T細胞抑制等[9，10]。最近有證據表明，抗原調變可能是AMIS發生的另一機制，此反應不依賴于RBC清除，而是RBC表面抗原表位減少或丟失，使循環中的RBC持續呈抗原陰性，從而避免免疫系統識別和殺傷[1，11]。但該反應只在RBC表達單一外源性抗原的小鼠模型中被發現，尚不清楚RBC同時表達多個抗原時，抗原調變反應能否實現[12-14]。未來的研究仍需將重點放在進一步確定抗-D IgG相關的AMIS作用，并確保產生有效的治療。

2 使用抗-D免疫球蛋白的臨床指征 孕婦懷有RhD+胎兒是否產生抗-D抗體、是否發生HDFN, 首先取決于胎兒紅細胞進入母體循環的時間、數量、概率，以及母體對胎兒紅細胞的免疫反應性, 因此檢測胎-母出血量是診斷、預防RhD HDFN的基礎。妊娠過程中，胎兒紅細胞通過胎盤進入母親體內稱為胎母出血（fetal-to-maternal hemorrhage，FMH）[15]。抗-D Ig預防的目的是減少胎母出血刺激母體產生抗-D抗體使母親致敏的幾率。凡是能引起胎兒紅細胞進入母體的事件均需要進行抗-D Ig預防，包括產前致敏事件（如羊膜穿刺術、葡萄胎吸引術、宮內手術等）、RhD+胎兒分娩后、人工剝離、胎兒宮內死亡及產婦紅細胞回收回輸等。同時為避免懷有RhD抗原陰性（RhD－）胎兒的RhD－母親進行不必要的抗-D Ig預防治療，需對RhD－孕婦進行胎兒RHD基因的無創性產前檢查（Non-invasive prenatal testing，NIPT），即檢測孕婦外周血中的胎兒游離DNA （Cell-free fetal DNA，cff DNA）[16-18]。有研究表明引入胎兒RHD基因的無創性產前檢查，僅對懷有RhD+胎兒的孕婦進行預防后，抗-D Ig的使用量減少約25.3%[19]、29%[20]。

3 抗-D免疫球蛋白的臨床應用 抗-D Ig的應用經歷了產后預防，產前出血預防及常規產前預防。未應用抗-D免疫球蛋白之前，懷有ABO血型與母體相容、RhD+的胎兒時，RhD－孕婦致敏產生抗-D的概率是16%；懷有ABO血型與母體不相容、RhD+的胎兒時，RhD－孕婦致敏產生抗-D的概率是2%；總體來看，懷有RhD+胎兒的RhD－孕婦致敏產生抗-D的概率是13.2%[21]。現最新《BCSH guideline for the use of anti-D immunoglobulin for the prevention of haemolytic disease of the fetus and newborn》（英國血液學標準委員會預防HDFN抗-D Ig應用指南）英國指南[22]：建議對孕齡＜12周的異位妊娠、葡萄胎、治療性終止妊娠以及子宮反復出血、大量出血或伴有腹痛的出血的RhD－孕婦預防注射，注射劑量≥250 IU。對孕齡12～20周發生致敏事件的孕婦注射≥250 IU 抗-D Ig，均不需做FMH檢測；孕齡20周后發生致敏事件后注射≥500 IU抗-D Ig，未致敏的RhD－孕婦發生了致敏事件均做FMH檢測，必要時追加注射適量抗-D Ig[23]。

所有未致敏的RhD－孕婦均做常規產前抗-D預防（routine antenatal anti-D prophylaxis，RAADP）注射，采用28周的單劑量1500 IU方案或28周和34周的雙劑量各500 IU方案均可；孕后期進行RAADP后，RhD－孕婦致敏產生抗-D的概率是0.37%[24]。嬰兒出生后采集臍血做ABO和RhD血型鑒定，一旦證實嬰兒為RhD+，所有此前未致敏的RhD－產婦均應在產后72 h內注射≥500 IU 抗-D Ig，產婦做FMH檢測，并根據試驗結果決定是否追加注射；產后72 h內應用合適劑量的抗-D Ig后，RhD－孕婦致敏產生抗-D的概率是1%～2% 。注射抗-D Ig時間為致敏事件發生＜72 h內，因故錯過該時限，≤10 d內注射仍有一定的保護作用。500 IU劑量的標準抗-D Ig最高保護4 mL胎兒紅細胞，1250 IU最高保護10 mL，1500 IU最高保護12 mL。按每1 mL胎兒紅細胞給予125 IU的公式計算額外的抗-D免疫球蛋白劑量，將出生后已給予的抗-D Ig計算在內，為避免不同批次產品的免疫暴露，應選擇和已使用標準劑量抗-D Ig統一批次的產品。

4 問題與展望 新生兒溶血病的發病機制通常與母嬰血型不合相關，其中，Rh血型不合引起的新生兒癥狀最為嚴重，尤其是抗原性最強的D抗原，可引起嚴重的溶血反應。目前預防HDFN最有效的方式是產前、產后和常規使用抗-D Ig，能明顯降低胎兒和新生兒溶血病的風險。如何有效評估胎兒是否存在發生HDFN的風險，并及時應用抗-D Ig預防治療，是現階段最需要注意的問題。胎兒血型產前基因診斷對HDFN的預防和治療具有重要意義。但仍存在以下局限性：①國內外雖然在無創檢測胎兒血型基因方面取得了一定進展，仍缺乏提取孕婦血漿中cff DNA的統一標準，cff DNA提取含量低導致檢測假陰性，需通過同時檢測內部對照物加以校正，如RHD陰性男胎的Y染色體基因序列（sry、dby和ttty2）和胎兒基因的短串聯重復序列及低甲基化啟動子序列等內部對照物已被有效地用于胎兒內部標記物；②不同種族之間的RHD基因存在異質性，國外適用的RHD基因的擴增方法不一定適合國人，需設計出符合我國人群血型基因的引物；③由于母體或胎兒遺傳背景中存在無活性的假基因（RHDψ或雜交RHD-CE-D），檢測結果可能會呈假陽性，避免攜帶RHDψ或雜交RHD-CE-D基因的個體出現假陽性結果，使用外顯子4或5中的RHD特異性引物辨別RHDψ或雜交RHD-CE-D個體中的野生型RHD核苷酸序列和單核苷酸多態性（SNPs）[25]。針對RHD血型不合HDFN的診療關鍵是及早檢查、及時確診并使用抗-D Ig預防治療。越早進行基因檢測，越能有效預防HDFN的發生。利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突