胎兒新生兒溶血病實驗室檢測專家共識*

中國輸血協會免疫血液學專業委員會

胎兒新生兒溶血病（hemolytic disease of the fetus and newborn，HDFN）是指因母嬰血型不合，母體針對與其不同的胎兒紅細胞血型抗原所產生的相應抗體經胎盤進入胎兒血液循環，導致胎兒或新生兒同種免疫性溶血引起的一系列臨床癥狀[1]。HDFN常導致早期流產，輕者出現貧血、水腫、肝脾腫大，重者如果未經處理，可能導致胎兒重度貧血、嚴重的新生兒高膽紅素血癥與核黃疸甚至死亡[2，3]。臨床上以ABO血型不合引起的HDFN多見，一般臨床癥狀較輕，偶爾有IgG高效價抗-A（B）抗體引起嚴重的ABO-HDFN案例報道[4，5]。非ABO-HDFN以Rh血型不合HDFN為主，其特點是起病急、進展快、溶血嚴重，容易發生膽紅素腦病及中樞神經系統疾病甚至死亡[6，7]。其他血型系統，包括MNS、Kell、Kidd及Duffy等血型系統也會引起不同程度的胎兒新生兒溶血病[8，9]。

隨著胎兒和新生兒醫學的不斷發展，尤其是非侵入性技術的廣泛應用，如孕婦外周血游離胎兒DNA（cell-free fetal DNA，cff-DNA）血型基因檢測、大腦中動脈峰值流速（MCA-PSV）多普勒檢測等，使得以往的HDFN檢測規范需進行修改。目前國外已經發布《孕婦血型和紅細胞抗體檢測指南》[10]及《存在紅細胞抗體孕婦管理指南》[11]，關于抗體檢測的知情同意、標本采集、抗體篩查時機、頻率和管理路徑、cff-DNA應用等方面，給出了詳細的推薦意見，值得我們借鑒與參考。而國內HDFN實驗室檢測尚待規范，仍存在各個實驗室間檢測項目、檢測方法及抗體篩查時機、頻次不完全統一，缺乏有針對性的質量控制，檢測項目缺項，如胎兒血型基因檢測、抗體效價及胎母出血檢測等問題，國內尚無實驗室常規開展。

1 實驗室檢測

1.1 檢測對象：具有不良妊娠史、HDFN史及RhD陰性，尤其存在不規則抗體、稀有血型而難以獲得相容性血液的備孕女性及孕婦。需注意申請單填寫時應明確標注流產史、妊娠史、輸血史及抗-D免疫球蛋白注射情況。

1.2 標本要求：采集備孕女性、孕婦、配偶或新生兒EDTA抗凝血3～5 mL，新生兒可使用臍血替代，非侵入性游離胎兒基因（cff-DNA）檢測采集妊娠≥16周孕婦外周血5～8 mL（推薦），侵入性胎兒基因檢測采用絨毛膜取樣或羊水穿刺術（慎用）。

1.3 檢測方案

1.3.1 產前檢查方案：所有孕婦在妊娠8～12周建檔時進行ABO和RhD血型鑒定，紅細胞不規則抗體篩查。抗體篩查陽性時需鑒定抗體特異性，進行抗體效價檢測；抗體篩查陰性時，妊娠28周復查，未檢測出有臨床意義的抗體時，孕婦不需要進一步做產前血型鑒定或抗體篩查（具體見2.4）。推薦進行胎兒非侵入性血型基因型檢測（cff-DNA），以確定胎兒血型，預測HDFN風險。當母親確定存在具有臨床意義的抗體，無法進行非侵入性胎兒基因型檢測時，推薦進行父親血型檢測，預測妊娠胎兒的風險。RhD陰性孕婦有潛在的致敏危險，應常規產前給予抗-D免疫球蛋白預防。

1.3.2 胎兒出生后檢測：可采集臍帶血或新生兒血樣進行直接抗人球蛋白試驗、游離抗體試驗、紅細胞抗體放散試驗，同時進行血紅蛋白（Hb）和膽紅素測定。

1.3.3 其它檢測：胎母出血檢測，對于羊膜穿刺術、異位妊娠、產前出血、宮內死亡、剖腹產等孕婦，及RhD陰性孕婦預防注射抗-D免疫球蛋白等，推薦進行胎母出血檢測。存在高效價IgG血型抗體時推薦進行cff-DNA、MCA-PSV及IgG抗體亞型檢測、單核細胞單層試驗。若臨床已采用MCA-PSV監測，抗體效價檢測的臨床價值有待商榷，尤其是抗體效價已達到臨床高危風險，可不做抗體效價測定。

1.4 檢測時機和頻次：①備孕女性懷孕之前可檢測或孕婦妊娠8～12周建檔時首次檢測，檢出抗-D或其他具有臨床意義的抗體（包括抗-E、抗-Ec、抗-M等），或IgG抗-A（B）效價≥64時，推薦檢測頻次：妊娠＜28周、1次/4周，妊娠28周至分娩、1次/2周，首次抗體效價可作為抗體基礎水平。首次抗體檢測為弱陽性而無法鑒定出特異性時，應在2～4周后復查，此時鑒定出特異性，檢測頻次同前；若仍為弱陽性無法鑒定特異性時妊娠28周復查。②首次未檢出具有臨床意義的抗體、抗體檢測一直為弱陽性或IgG抗-A（B）效價＜64時，妊娠28周后進行復查，若仍為陰性或IgG抗-A（B）效價沒有變化則正常分娩；若抗體檢測為弱陽性或檢出具有臨床意義的抗體，或抗-A（B）效價升高≥2個稀釋度（如首次效價為2，現在上升至8），推薦檢測頻次：妊娠28周至分娩、1次/2周。

1.5 檢測方法

1.5.1 孕婦及配偶ABO、RhD血型鑒定：采用經國家批準且檢定合格的單克隆IgM抗-A、抗-B、抗-D，A型、B型、O型試劑紅細胞，推薦使用試管法或微柱凝膠法。ABO血型必須經過正反定型確認，RhD血型可經鹽水法初篩及RhD陰性確認試驗。若孕婦RhD血型無法確證陽性，應按照RhD陰性管理；若孕婦確認RhD陰性，應書面及口頭告知孕婦及臨床醫生，并建議給予抗-D免疫球蛋白預防。

1.5.2 孕婦紅細胞不規則抗體篩查及鑒定：選擇經國家批準且檢定合格的抗體篩查細胞及抗體鑒定細胞，使用微柱凝膠抗人球蛋白法進行檢測。檢出具有臨床意義的抗體時，應口頭或書面告知孕婦或臨床醫生抗體特異性及可能引起HDFN的風險，并告知輸血時可能難以獲得相容性血液的風險。中國黃種人引起HDFN的抗體主要是IgG抗-A（B）和抗-D、抗-E，關于IgG抗-A（B）和抗-D、抗-E效價與HDFN發病率的報道相對較多，而抗-Ec、抗-M和抗-c、抗-K等抗體引起HDFN多為個案報道，抗體效價與發病率情況不明確。

1.5.3 孕婦紅細胞不規則抗體效價/濃度測定：孕婦不規則抗體篩查陽性鑒定出抗體特異性時，進行抗體效價測定，應增加抗-D血型定型試劑效價國家參考品（效價1∶64）作為室內質控，我國已有“抗-D（IgM）血型定型試劑效價測定用國家參考品”，可作為質控品保證檢測結果的重復性和可靠性。抗體濃度測定需要國家標準物和專門設備，測定結果報告形式為IU/mL，國外有抗-D和抗-c國家標準參考品，可以進行抗體濃度測定參考[12，13]。若有可能，試驗時將先前效價檢測標本作為平行對照，避免因試驗方法導致差異。

ABO血型不合孕婦IgG抗-A（B）抗體效價測定，國外大多不推薦此項檢測。我們對國內ABO血型不合HDFN數據進行了Meta分析及統計學分析，認為中國黃種人群ABO血型不合HDFN發病率高，重癥者時有報道，有必要進行IgG抗-A（B）抗體測定[14]。IgG抗-A（B）抗體效價檢測應使用巰基試劑破壞IgM抗體，如2-巰基乙醇（2-Me）或二硫蘇糖醇（DTT）。傳統的試管抗人球蛋白法易受人為因素影響，推薦使用微柱凝膠抗人球蛋白法進行效價測定。

根據IgG抗-A（B）效價與ABO-HDFN關系的Meta分析發現：IgG抗-A（B）效價＜64，發病率4.01%（低風險）；64≤IgG抗-A（B）效價＜128，發病率18.87%（中等風險）；128≤IgG抗-A（B）效價＜256，發病率51.27%（高風險）；256≤IgG抗-A（B）效價＜512，發病率74.20%（高風險）；IgG抗-A（B）效價≥512，發病率92.13%（高風險）[14]。關于抗-D效價與HDFN發病率的統計分析顯示：IgG抗-D效價＜16，發病率5.40%（低風險）；16≤IgG抗-D效價＜32，發病率33.33%（中等風險）；32≤IgG抗-D效價＜64，發病率81.81%（高風險）；64≤IgG抗-D效價＜128，發病率92.11%（高風險）；128≤IgG抗-D效價＜256，發病率95.65%（高風險）；IgG抗-D效價≥256，發病率100.0%（高風險）。根據抗體強度綜合臨床癥狀采取相應的妊娠管理方案指導（表1，2）。

1.5.4 單核細胞單層試驗（monocyte monolayer assay，MMA）：該實驗主要用于評估孕婦血清IgG抗體的臨床意義，通過體外觀察單核細胞粘附和吞噬致敏紅細胞的情況，預判抗體在機體內可能引發免疫反應的強弱程度[15]。如檢測到＞20%活性單核細胞，預測95%的病例需要治療；＜20%者預測83%不需要治療，該實驗比抗體效價能更好地預測HDFN的嚴重程度。

表1 IgG抗-A（B）抗體效價與妊娠管理

表2 抗-D效價與妊娠管理

1.5.5 胎兒基因檢測：推薦采用妊娠≥16周孕婦外周血，進行非侵入性cff-DNA檢測，8 h內完成血漿分離及胎兒游離DNA提取，判定孕婦是否存在HDFN風險[16]。RhD陰性孕婦推薦cff-DNA檢測以確定胎兒RhD血型基因型，可有針對性的進行產前預防抗-D免疫球蛋白注射，避免不必要用藥，未產生抗-D孕婦進行cff-DNA檢測，可減少孕婦產前檢查頻次[17]。

1.5.6 胎兒出生后檢測：采集新生兒血樣或胎兒娩出后采集臍帶血，進行直接抗人球蛋白試驗、游離抗體試驗、紅細胞抗體放散試驗及Hb和膽紅素測定。直抗試驗紅細胞需充分洗滌避免結果假陽性，放散試驗中ABO系統抗體采用物理放散（冷、熱放散法）或酸放散，ABO系統以外的抗體采用化學放散法，如乙醚放散、酸放散。直抗陽性不能完全診斷HDFN，放散試驗檢出抗體特異性是HDFN診斷的重要依據。除了實驗室檢測，HDFN診斷應綜合臨床表現最終確診。

1.5.7 胎母出血（fetomaternal hemorrhage，FMH）檢測：FMH主要因病理性妊娠、侵襲性檢查、宮內治療及分娩等，使胎兒紅細胞經胎盤絨毛間隙進入母體血液循環，引起胎兒免疫性溶血性反應，可造成胎兒嚴重貧血、宮內缺氧，甚至死胎[18]。FMH檢測有助于明確診斷和了解胎兒宮內狀態，評估HDFN發生風險和新生兒預后，指導RhD陰性孕婦注射抗-D免疫球蛋白（immune globulin，Ig）的劑量。檢測方法主要采用酸洗脫染色試驗和流式細胞術，計算胎兒紅細胞的比例，估算胎兒出血量[19]。目前認為當胎兒出血量達到胎兒血容量20%時（20 mL/kg），認為是大量胎母出血，綜合臨床情況診斷HDFN，必要時進行妊娠干預[20]。妊娠＜20周孕婦FMH量一般比較少，不必進行FMH檢測。妊娠＞20周的RhD陰性孕婦發生致敏事件及分娩RhD陽性新生兒時，通常進行FMH檢測。根據FMH檢測的胎兒出血量，一般情況下，500 IU抗-D Ig可清除4 mL胎兒紅細胞，1500 IU清除12 mL。

檢測方法包括酸洗脫染色試驗和流式細胞術，前者主要用于篩查FMH，若胎兒紅細胞≤2 mL，500 IU抗-D Ig足以清除胎兒紅細胞；若胎兒紅細胞＞2 mL，采用流式細胞術進行D陽性紅細胞檢測最終確定出血量和抗-D Ig劑量[21]。酸洗脫染色試驗（kleihauer-betke test，KBT）是FMH常用檢測方法，胎兒血紅蛋白（HbF）抗酸能力強于成人血紅蛋白（HbA），孕婦血涂片經酸性緩沖液洗脫后，只有含HbF紅細胞被伊紅染色，從而區分出胎兒紅細胞和孕婦紅細胞，顯微鏡下計數染色細胞占全部紅細胞的比例以確定胎兒紅細胞的比例，正常值≤3%。流式細胞術（flow cytometer，FMC）：FMH驗證試驗，通過熒光標記胎兒HbF特異性抗體及其他抗體，利用FMC高分辨率和分選能力，自動化分析儀定量檢測孕婦外周血中胎兒HbF紅細胞，分析計數胎兒紅細胞比例，比KBT方法靈敏度高、可重復性強。

1.5.8 高效價IgG抗體亞型檢測：IgG抗體有4種亞型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，各亞型激活補體及穿過胎盤的能力不同，與紅細胞結合后激活補體能力順序為IgG1＞IgG3＞IgG2＞IgG4。對高效價IgG抗體的孕婦血漿測定IgG亞型的含量，可預測HDFN的發生概率及嚴重程度。常用檢測方法包括傳統的酶聯免疫吸附（ELISA）試驗和流式細胞術，可定量分析孕婦血清中IgG抗體各亞型的濃度；另外，新型微柱凝膠技術是將抗原抗體特異性反應、生化凝膠過濾分子篩技術、間接抗人球蛋白技術結合，在微柱凝膠卡反應柱中包被抗人IgG亞型的單抗試劑，檢測IgG抗體亞型，操作簡便，檢測結果特異性和穩定性較好[22]。

1.5.9 胎兒大腦中動脈峰值流速（MCA-PSV）測定：IgG抗體效價明顯升高時，采用多普勒超聲技術進行胎兒大腦中動脈峰值流速（MCA-PSV）測定，根據胎兒貧血的病理生理改變，包括胎兒形態學及血流動力學變化有效監測胎兒貧血程度，當MCA-PSV值＞1.5 MoM（中位數）時，即需要進行臨床干預[23，24]。

2 質量控制

2.1 有質控品要求：推薦使用國家藥品監督管理局批準的試劑和質控品，與受檢標本必須采取相同試驗操作步驟。質控結果與預期靶值相符，結果在控，受檢標本檢測結果可用；質控結果與預期靶值不相符，結果失控，受檢標本檢測結果不可用，需查找原因、糾正影響因素后，重復檢測。

2.2 無質控品要求：對于無質控品的實驗室檢測，如血型基因檢測、胎母出血檢測等，每次試驗均應設置陽性對照和陰性對照，保證試驗的準確性。

參與制定及修改本共識的專家 ：駱群（解放軍總醫院第五醫學中心輸血科），朱自嚴（上海市血液中心），苗天紅（北京市紅十字血液中心血型研究室），徐群（山東省血液中心血型研究室），姬艷麗（廣州市血液中心血型研究室），向東（上海市血液中心血型研究室），徐華（陜西省血液中心血型研究室），尹文（空軍軍醫大學西京醫院輸血科），封志純（解放軍總醫院第七醫學中心附屬八一兒童醫院），魏瑗（北京大學第三醫院婦產科），周玲（戰略支援部隊特色醫學中心婦產科），張曉卿（北京大學第三醫院輸血科）。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突