HPLC法測定鹵肉制品中日落黃含量的方法研究

何雪丹，吳淑瑤，朱丹倩，成圣平

（1.浙江金正檢測有限公司，浙江義烏 322000；2.贊宇科技集團股份有限公司，浙江杭州 310000）

合成著色劑包含日落黃、胭脂紅、莧菜紅、赤蘚紅、檸檬黃、亮藍和誘惑紅等[1]。日落黃為橙色的顆粒或粉末、無臭、易溶于水、不溶于油脂，0.1%水溶液呈橙黃色。日落黃，由對氨基苯磺酸重氮化，與2-萘酚-6-磺酸偶合，經精制而得有一定的毒性[2]。與天然色素相比，日落黃價格低廉、顏色鮮艷、不易褪色，因此雖然過量攝入會引起人體過敏、腹瀉，且攝入量超過肝臟負荷時，會在體內蓄積，對腎臟、肝臟產生一定傷害，但日落黃在食品中的不規范使用的現象仍廣泛存在[3-4]。

鹵肉制品是我國傳統的一大類肉制品，歷史悠久，受眾廣泛[5]。鹵肉制品中不允許添加合成著色劑，目前對鹵肉制品中合成著色劑的檢測參照《食品中合成著色劑的測定》（GB 5009.35—2016）、《肉制品 胭脂紅著色劑測定》（GB/T 9695.6—2008）、《食品中誘惑紅、酸性紅、亮藍、日落黃的含量檢測》（SN/T 1743—2006）等標準方法進行，但以上標準中的聚酰胺粉吸附法、液-液分配法等方法存在實驗過程煩瑣、重現性差、檢測成本高等現實問題，無法滿足實際檢測需要。因此，需要建立一種方便、快捷、重現性好、實用性高、包容性大的日落黃檢測方法，用于批量檢測市場在售的相關食品。此方法的建立，對加大日落黃的監管力度，保證我國居民食品衛生安全有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；3-18KS高速冷凍離心機（德國Sartorius公司）；純水凈化儀（杭州永潔達凈化科技有限公司）；MS3basic振蕩器（IKA公司）。

日落黃（純度99.00%）購于北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制

稱取適量日落黃標準品，以水為溶劑，配制成100 μg/mL的單標儲備液，避光冷藏保存；按需要用水稀釋成適當濃度的混合標準工作液，現配現用。

1.2.2 色譜條件

Thermo Scientific C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫 25 ℃；流速 1 mL/min；進樣量 20 μL；流動相A為0.02 mol/L乙酸銨，B為甲醇；梯度洗脫程序：0 min，11%B；0～4 min，11%～60%B；4～7 min，60%～95%B；7～8 min，95%B；8～10 min，95% ～ 60%B；10～ 11 min，60% ～11%B；11 min，11%B。

1.2.3 提取方法

準確稱取5 g（精確至0.01 g）均勻樣品于50 mL具塞離心管中，加入25 mL超純水，渦旋振蕩1 min，混勻，用超純水定容至50 mL，放入80 ℃水浴30 min，每隔10 min搖勻1次，水浴結束后，在6 000 r/min的轉速下離心5 min。取上清液過0.45 μm水相濾膜，待上機測定。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

2.1.1 檢測波長的選擇

本試驗選取 Thermo Scientific C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），在紫外檢測器150～600 nm波長下對日落黃進行波段掃描，波長為270 nm和480 nm處有吸收峰，實驗表明，270 nm下目標峰與雜質峰并不能明顯分離、干擾較大，480 nm下則能達到較好的分離效果。

2.1.2 流動相體系優化

選定0.02 mol/L的乙酸銨-甲醇作為流動相，同一濃度進樣，改變流動相比例，比較分離效果及保留時間。本試驗選取0.02 mol/L的乙酸銨-甲醇（50∶50）（V∶V）、（60∶40）（V∶V）、（70∶30）（V∶V）和（80∶20）（V∶V）等度洗脫以及梯度洗脫對比。由圖1和圖2可知，0.02 mol/L乙酸銨-甲醇（70∶30）（V∶V）的等度洗脫方式與1.2.2中的梯度洗脫方式相比，在保證分離效果的情況下都能保證較短的分離時間，節省時間及流動相成本。考慮到在實際檢測中與其他合成著色劑共同檢測，本試驗選擇了梯度分離方式。因此本法選用480 nm為檢測波長，選取0.02 mol/L乙酸銨-甲醇梯度洗脫為流動相體系。

圖1 梯度洗脫日落黃標準品HPLC圖譜

圖2 等度洗脫日落黃標準品HPLC圖譜

2.2 提取條件選擇

2.2.1 提取劑及提取方式的選擇

本試驗選取已知日落黃含量的鹵肉陽性樣品，在相同提取時間下，比較不同溫度熱水浴、超聲水浴、乙醇超聲提取的提取效率。試驗結果如表1，結果表明日落黃不溶于乙醇，超聲提取的作用不大，熱水浴提取效果最佳。其中當熱水浴溫度≥80 ℃后，提取效果趨于穩定，考慮到節約能效及實驗安全，試驗表明80 ℃水浴提取為回收率最高的提取方式。

表1 不同提取方式的回收率試驗結果

2.2.2 提取時間的優化

由表2可知，選定80 ℃水浴為提取方式，將已知日落黃含量的鹵肉陽性樣品分組，分別水浴提 取 5 min、15 min、30 min、45 min、60 min和80 min，比較回收率。試驗結果表明，提取時間≥30 min后，回收率趨于穩定，考慮節省實驗時長，提高效率，本試驗選取30 min為最佳提取時長。

表2 不同提取時間的回收率試驗結果

2.3 方法線性關系、精密度和檢出限

由表3、表4可知，日落黃在0.05～5.00 μg/mL線性良好，相關系數大于0.999，鹵肉樣品基質中在3個濃度水平加標試驗回收率在81.0%～93.8%，相對標準偏差（RSD）為1.21%～2.51%，方法檢測限（LOD，S/N≥3）為0.5 mg/kg。本方法方便、快捷、重現性好、實用性高及包容性大。

表3 日落黃的線性方程、儀器檢出限及方法檢出限

表4 鹵肉中低中高濃度加標回收率和精密度

圖3 日落黃檢出限（0.05 μg/mL）HPLC圖譜

3 方法驗證

應用本方法對隨機抽取的鹵肉樣品進行測定，共計40個樣品。其中1個樣品檢出日落黃，檢出濃度為0.017 g/kg，其余39批未檢出。對比本方法與日常用于檢測食品中合成著色劑的方法，實驗效率顯著提升，實驗成本有所下降，因此本實驗適用于日常大批量的樣品檢驗。

4 結論

本文建立了高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定鹵肉制品中日落黃含量的方法。與日常使用的標準方法相比，本方法在保證準確性好、靈敏度高的同時，盡可能省去了復雜的前處理，提高了實驗效率。本方法方便、快捷、重現性好、實用性高、包容性大，檢測結果可靠，本方法的建立為食品中測定鹵肉制品中日落黃含量的研究提供了數據和基礎。