空腹血糖受損患者KCNB1 基因rs1051295 位點多態性與特異組織胰島素抵抗的關系

文靜翟琪張藝博何燕

1 首都醫科大學公共衛生學院，北京100069；2 臨床流行病學北京市重點實驗室

糖尿病的危險因素包括環境因素（如飲食模式、 生活方式等）、遺傳因素和表觀修飾等，2 型糖尿?。═2DM）的遺傳度為30%～70%［1］。目前，連鎖分析、候選基因法和全基因組關聯研究（GWAS）已經成功確認了全球主要人種的100 多個T2DM 易感基因，其中大部分在歐洲人群中發現［2］。Li 等［3］報道，中國漢族人群PAX4 rs10229583 多態位點在胰島β細胞發育過程中起關鍵作用，可能會使T2DM 風險增加18%。KCNB1基因編碼由857個氨基酸組成的電壓門控性鉀通道2.1亞型（Kv2.1通道），主要分布于腦皮質、海馬等腦內組織，心房、心室、骨骼肌、肺動脈平滑肌等肌肉組織，胰島β 細胞及視網膜等［4］。其主要功能是控制膜電位，參與神經及內分泌物質的釋放、細胞的分化、活化、增殖及凋亡等生理過程。我們的前期研究顯示，中國漢族人群中KCNB1基因3"非翻譯區（3" UTR）的rs1051295 位點的基因多態性與T2DM 的發生相關，基因型TT 通過降低外周胰島素敏感性進而導致T2DM 的發病風險升高［5］。由于外周胰島素抵抗來源于特異組織，在人體內最主要的胰島素敏感組織包括肝臟、肌肉和脂肪組織［6］；因此我們推測，KCNB1 基因rs1051295 位點多態性與胰島素敏感的特異組織即肝臟和骨骼肌組織胰島素抵抗之間可能存在關聯。本研究探討了空腹血糖受損患者KCNB1 基因rs1051295 位點基因多態與特異組織胰島素抵抗之間的關聯，旨在識別rs1051295 發揮其功能影響胰島素敏感性的特異組織。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年9月—2010年11月在北京宣武醫院就診的76例空腹血糖受損患者，其中男33例、女43例。納入標準：空腹血糖6.1～7.0 mmol/L，收縮壓（SBP）＜140 mmHg，舒張壓（DBP）＜90 mmHg，BMI 18.5～24.0 kg/m2。排除腫瘤、器質性疾病患者及妊娠婦女。本研究經首都醫科大學倫理委員會批準，研究對象均知情同意。

1.2 KCNB1基因rs1051295位點多態性檢測 禁食8～12 h后，采集肘靜脈血2 mL，加入EDTA 抗凝管中，-4 ℃冰箱保存，用于提取全血DNA。①基因組DNA 提?。菏褂肨aKaRa 的全基因組DNA 提取試劑盒，按操作說明進行基因組DNA 的提取。②引物合成：根據基因庫（GeneBank）上公布的KCNB1基因序列（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/pubmed/）設計引物，此序列在GeneBank 中的編號為NT_002370。運用Primer5軟件設計引物，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。上游引物：biotin-GCGCAAAACCCTTACTCAAAT，下 游 引 物 ：GCCAGGGGGCAATTAGAAT。③基因型檢測：擴增目的基因片段，PCR 反應體系（50 μL）：100 ng 基因組DNA，0.5 pmol 引物，2×Master Mix（反應緩沖液，MgCl2和DNA 聚合酶，日本ToYoBo）。反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃30 s，59 ℃30 s，72 ℃1 min，40 個循環，最后72 ℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。使用PSQ96全自動焦磷酸測序儀進行基因型測定及分型。取PCR擴增產物制備生物素標記的單鏈DNA模板，再將洗脫分離的單鏈DNA 模板在PSQ96 Plate 內與測序引物混合，80 ℃孵育2 min，自然冷卻至室溫后放入PSQ96MA 儀器上進行等位基因序列測定。通過PSQ96MA 系統進行等位基因分型分析，將實際所得測序峰圖與軟件自動生成的3 種基因型對應的模式峰圖比較，最終判斷該樣本的基因型?；蚍中蜋z出率為100%（76/76）。在5%的隨機樣品中重復進行基因分型以進行驗證和質量控制，基因型數據錯誤率＜1%。

1.3 糖耐量檢查及肝臟組織胰島素抵抗指數（Hepa-IRI）和骨骼肌組織胰島素敏感指數（Mus-ISI）測算 患者禁食10 h后，口服75 g葡萄糖溶液，實施OGTT，檢測0、30、60、120 min 的血糖（Glu0、Glu30、Glu60、Glu120）和 胰 島 素（Ins0、Ins30、Ins60、Ins120）。根據血糖和胰島素濃度繪制曲線，計算曲線下面積（AUC）。Hepa-IRI=GlutAUC（0-30）×InstAUC（0-30），GlutAUC（0-30）和InstAUC（0-30）分別為OGTT 前30 min 內血糖 和胰 島素 的AUC。Mus-ISI=（dG/dt）/I，dG/dt 為OGTT 血糖濃度從最高峰到最低點的衰減速率，I 為OGTT過程中血漿平均胰島素濃度［6］。

1.4 統計學方法 采用Epidata、SPSS23.0 軟件進行數據分析。計數資料以百分數表示，組間比較采用χ2檢驗；正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗或方差分析；偏態分布的計量資料以中位數（M）和四分位間距（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。正態性檢驗采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗，對不符合正態分布的計量資料采用log變換。采用多重線性回歸模型分析不同基因型與Heap-IRI和Mus-ISI 的關聯，并校正T2DM 相關的性別、年齡和BMI 等因素對其的影響，給出偏回歸系數（b）及95%可信區間（95%CI）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KCNB1 基因rs1051295 位點多態性檢測結果KCNB1 基因的rs1051295 位點存在T 和C 兩種等位基因，基因頻率分別為50.65%（77/152）、49.35%（75/152）。TT、TC、CC 基因型的分布頻率分別為23.68%（18/76）、53.95%（41/76）和22.37%（17/76）。

2.2 KCNB1 基因rs1051295 位點不同基因型Hepa-IRI、Mus-ISI 比較 由于TC 和CC 基因型的Hepa-IRI、Mus-ISI 水平相近，為了觀察TC 與CC 的累加效應，我們將TC+CC 進行聯合分析。TT 基因型Hepa-IRI 高于TC、CC、TC+CC，Mus-ISI 低于TC、CC、TC+CC（P均＜0.05），TC與CC比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 KCNB1基因rs1051295位點不同基因型患者Hepa-IRI、Mus-ISI比較［M（P25，P75）］

2.3 KCNB1基因rs1051295位點不同基因型患者的臨床資料比較 見表2和表3。TT、TC、CC基因型之間比較以及TT與TC+CC 比較，性別、年齡、BMI、TC、TG、SBP、DBP、血糖均無統計學意義（P 均＞0.05）。OGTT 結果顯示，TT 基因型Ins30 水平高于TC、CC、TC+CC，Ins120水平高于CC和TC+CC（P均＜0.05）。

表2 KCNB1基因rs1051295位點不同基因型患者的性別、年齡、BMI、血壓、血脂比較［mmol/L，±s/M（P25，P75）］

表2 KCNB1基因rs1051295位點不同基因型患者的性別、年齡、BMI、血壓、血脂比較［mmol/L，±s/M（P25，P75）］

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表3 KCNB1基因rs1051295位點不同基因型患者的血糖、胰島素比較［±s/M（P25，P75）］

表3 KCNB1基因rs1051295位點不同基因型患者的血糖、胰島素比較［±s/M（P25，P75）］

注：與TT基因型比較，*P＜0.05。

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2.3 KCNB1 基因rs1051295 位點不同基因型與Hepa-IRI、Mus-ISI 的相關性 見表4。將基因型TT 分別與TC、CC 和TC+CC 相比較，結果顯示基因型TT 與Hepa-IRI 存 在 正相關、與Mus-ISI 存在負相關。校正性別、年齡、BMI 后，將基因型TT分別與TC、CC 和TC+CC 相比較，結果顯示基因型TT 與Hepa-IRI 存 在 正 相 關、與Mus-ISI 存 在 負相關。

表4 rs1051295位點不同基因型與Hepa-IRI及Mus-ISI的相關性

3 討論

外周組織胰島素抵抗是2 型糖尿病的重要病理生理學機制，特異組織胰島素抵抗是外周組織胰島素抵抗的重要來源［6］。我們的前期研究證實，KCNB1 基因rs1051295 位點多態性與外周組織胰島素抵抗之間存在關聯［5］。本研究結果顯示，空腹血糖受損患者KCNB1 基因rs1051295 位點的TT 基因型與TC、CC 和TC+CC 相比較，Hepa-IRI 和Mus-ISI水平升高，在校正性別、年齡和BMI 后，TT 基因型與Hepa-IRI 正相關、與Mus-ISI 負相關，即TT 基因型與Hepa-IRI 升高、Mus-ISI 降低相關。表明TT 基因型與特異組織胰島素抵抗存在關聯。

Kv2.1 通道由KCNB1 基因編碼，其主要功能是控制膜電位，參與神經及內分泌物質的釋放、細胞的分化、活化、增殖及凋亡等生理過程［4］。KCNB1基因多態性可能會影響Kv2.1通道表達量及細胞膜上功能性通道的組裝［7］，與多種疾病相關。美國一項針對高血壓疾病的研究發現，在非裔美國人群中，位于KCNB1 內含子區的rs756529 位點與左心室肥厚有關，提示高血壓患者左心室肥厚發展的潛在機制［8］。另一項研究證實，在日本人群中，位于KCNB1 外顯子區的1071 C＞T 以及768 G＞A 位點突變與長QT 間期綜合征發生相關［9］。PEREZ 等［10］研究顯示，位于KCNB1 編碼區的c. 1133T＞C 位點突變與特發性癲癇腦病的發病直接相關，該變異導致Kv2.1 V378A通道表達以及亞細胞定位缺陷是癲癇腦病的遺傳病病因之一。除此之外，美國另一項GWAS 研究還報道了位于KCNB1 的3" UTR 的rs1051295 位點通過與HLA-DRB1基因的相互作用而與風濕性關節炎相關，為Kv2.1 通道蛋白與炎癥反應相關的作用機制提供了遺傳學證據支持［11］。在人類［12-13］和嚙齒動物［12，14］中，由KCNB1 編碼的Kv2.1 通道是主要的β細胞Kv 通道，70%的K+由此外流，小鼠Kv2.1 缺失會引起嚴重的胰島素釋放和血糖紊亂。我們的前期研究顯示，編碼Kv2.1 通道蛋白的KCNB1 基因rs1051295位點TT基因型與外周胰島素抵抗相關［5］，TT通過降低外周胰島素敏感性導致T2DM的發病風險增高。進一步探討KCNB1 基因多態與脂代謝和胰島素抵抗之間的關聯，發現許多KCNB1基因非連鎖標簽基因多態性與TC、TG、LDL 和外周胰島素抵抗相關，提示KCNB1 基因編碼的Kv2.1 通道蛋白可能參與脂代謝的調控過程，進而影響胰島素敏感性［15］，為深入認識遺傳因素在T2DM 發病過程中的作用提供了依據。

本研究結果顯示，基因型TT 在OGTT 30 min 時Ins 水平均高于TC 和CC，并且TT 在30 min 和120 min 時Ins 水平高于TC+CC。這可能與胰島素抵抗導致的β細胞代償分泌胰島素相關?？崭寡钱惓Ｅc肝臟組織胰島素抵抗相關，餐后血糖異常與脂肪組織胰島素抵抗相關。TT 基因型與肝臟組織胰島素抵抗相關，肝臟組織胰島素抵抗導致過多的肝糖原分解成甘油和葡萄糖，引起空腹血糖的升高，進一步引起β 細胞代償分泌胰島素，引起高胰島素血癥［16］。骨骼肌組織胰島素敏感性降低引起骨骼肌組織胰島素抵抗，導致糖原無法儲存在骨骼肌組織中，引起餐后血糖升高，導致胰島素代償分泌，引起胰島素水平升高［6］。肝臟和骨骼肌組織的胰島素抵抗進一步促進外周組織胰島素抵抗，血糖水平升高和胰島素分泌增加進一步加重，最終導致β 細胞功能的失代償，引起T2DM的發生。

綜上所述，空腹血糖受損患者KCNB1 基因rs1051295 位點TT 基因型與特異組織胰島素抵抗存在關聯；KCNB1 基因rs1051295 位點TT 基因攜帶者肝臟和肌肉組織胰島素抵抗風險顯著升高。本研究存在的局限性：首先，樣本量較少，未來需要在大樣本的人群中驗證這種關聯；其次，本研究是在漢族人群中進行的，是否在其他的種族也存在這樣的關聯尚不清楚；最后，由于數據收集過程缺乏游離脂肪酸等指標，因此無法對脂肪組織胰島素抵抗指數進行計算，故本研究只納入了肝臟和肌肉組織胰島素抵抗，下一步我們將繼續研究TT基因型與脂肪組織胰島素抵抗的關聯。