茶皂素殺螺活性及對3 種水生生物的安全性

麻程軍, 王 瑞, 劉 彬, 黃 斌, 侯有明, 湯寶珍*,

(1. 福建農林大學 閩臺作物有害生物生態防控國家重點實驗室，福州 350002；2. 福建農林大學 植物保護學院，福建省昆蟲生態重點實驗室，福州 350002)

福壽螺 Pomacea canaliculata 原產于南美洲亞馬遜河流域，是一種嚴重危害水稻和其他水生植物的軟體動物，已被世界自然保護聯盟(International Union for Conservation of Nature，IUCN) 列入全球100 種最具破壞性的外來入侵物種，自1980 年進入中國后逐漸為害成災[1-2]。福壽螺取食可導致水稻幼苗死亡，顯著降低水稻產量[3]。Nghiem 等 2013 年應用 Monte-Carlo 模型統計發現，全球每年因福壽螺為害水稻造成的經濟損失高達14.7 億美元[4]。此外，福壽螺還是廣州管圓線蟲 Angiostrongylus cantonensis 的中間寄主，該線蟲可引發人體嗜酸性腦膜炎，而福壽螺的擴散速度和暴發范圍直接影響該病的發病強度[5]。因此，有效防控福壽螺顯得尤為重要。目前比較有效的手段主要有生物防治、物理防治和化學防治。生物防治主要利用放鴨捕食小螺、幼螺，但鴨群本身也會對水稻秧苗造成危害。物理防治常以人工采螺為主，效率低且效果差[6]。化學防治主要采用殺螺胺乙醇胺鹽 (niclosamide ethanolamine)、四聚乙醛 (metaldehyde) 等藥劑，雖然效果良好，但存在為害非靶標生物[7-8]、農藥殘留[9]及抗藥性[10]等問題。因此，尋找合適的、對環境友好的殺螺劑迫在眉睫。

植物源農藥是利用植物次生代謝產生的化學物質作為殺蟲、殺菌及除草等用途的農用化學品，具有生物活性高、選擇性強以及對非靶標生物安全等優勢[11]，同時還具有低殘留、易降解、不易引起抗藥性等有機合成農藥無法比擬的特點[12-13]。研究表明，植物源殺螺劑如昆諾阿藜 Chenopodium quinoa Willd 皂苷[14-15]、油茶 Camellia oleifera Abel籽餅[16]等因具備對環境友好等特性，具有開發成為綠色農藥的潛力[17]。

茶皂素 (tea saponin) 是山茶科 (Theaceae) 山茶屬 (Camellia L.) 植物中皂素的統稱，廣泛存在于各種茶類植物的根、莖、葉、花和果實中。日本學者青山新次郎于1931 年首次從茶樹種子中分離出茶皂素，并發現其為一類齊墩果烷型三萜類皂苷混合物[18]。茶皂素含量高，且提取成本低，茶樹根中的茶皂素含量可達14.83%，茶籽殼中為8.16%[19]，茶籽餅中約為12%[20]。茶皂素是一種性能優良的天然非離子型表面活性劑，具有良好的抗氧化、鎮痛、抗炎、降血壓、保護心肌等藥理功能[21]，此外還可用于洗滌、去污、發泡和乳化等領域[22]。

早在1998 年，王小藝等[23]就測定了茶皂素對福壽螺的活性。結果表明，采用有效成分質量濃度為2.5 mg/L 的茶皂素處理福壽螺幼螺，3 d 后死亡率可達100%，同時其對成螺雖然也有一定的抑制作用，但防治效果較差，低濃度下對個體大的成螺基本無效。王志高等[24]分別在室內和大田環境下研究了生石灰、碳酸氫銨、茶麩和25%茶皂素4 種物質對福壽螺的防治效果，發現茶皂素、茶麩和生石灰對稻田福壽螺均有很好的防治作用。賢振華等[25]分別用LC25和LC50劑量的茶皂素進行處理，發現其對福壽螺螺苗 (個體質量約0.15 g)、仔螺 (約 1.0 g) 及中螺 (約 4.0 g) 的生長均有一定的抑制作用，其作用效果受茶皂素濃度及福壽螺發育階段影響。

盡管已有相關研究表明茶皂素對福壽螺具有良好的毒殺效果，但尚缺乏利用茶皂素在田間防治福壽螺的較為系統的研究，也尚未見有關茶皂素環境安全性評價的研究報道。鑒于此，筆者全面測定了茶皂素對福壽螺的室內活性、評價了其對3 種水生生物的安全性，并在此基礎上進行了田間藥效試驗，旨在為合理利用茶皂素防控福壽螺提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑及主要儀器

60%茶皂素 (tea saponin) 原粉，福建省南平市順昌縣老知青集團提供；6% 四聚乙醛顆粒劑(metaldehyde 60 GR)，廣東農密生物科技有限公司生產；50%殺螺胺乙醇胺鹽可濕性粉劑 (niclosamide ethanolamine 500 WP)，上海滬聯生物藥業股份有限公司生產。TU-1900 雙光束紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 供試生物

福壽螺 P. canaliculate，采自福建農林大學金山校區教學實習用水稻田。試驗前在與試驗相同環境下馴養7 d，馴養期間每天喂食甘藍葉1 次，投喂量以2 h 內吃完為準。于試驗開始前24 h 停止喂食，及時清除糞便及食物殘渣。整個試驗期間不喂食，控制室溫為 27 ℃，每日光照12～16 h。試驗用水為光照去氯處理 24 h 以上的自來水。

斑馬魚 Barchydonio rerio，購自福州市海洋之星水族館，體長 (2.0 ± 1.0) cm、質量 (0.3 ± 0.1) g，健壯無病，大小一致。試驗前在與試驗相同環境下馴養7 d，馴養期間每天喂食魚食1～2 次，投喂量以5 min 內吃完為準。于試驗開始前24 h 停止喂食，及時清除糞便及食物殘渣。整個試驗期間不喂食，水溫控制在21～25 ℃，每日光照12～16 h。試驗用水為曝氣處理24 h 以上的自來水，硬度60 mg/L (以 CaCO3計)，pH 值在 6.0～8.5 之間，溶解氧高于空氣飽和值的60%。

大型溞 Daphnia magna，購自中國科學院水生生物研究所，保持良好的培養條件，使其保持孤雌生殖狀態。選用來源于同一母系、室內條件下培養3 代以上、出生24 h 內的健康非頭胎溞供試。以室內培養的羊角月牙藻每天喂食1 次，水溫控制在18～22 ℃，每日光照12～16 h。溞的培養、馴化及試驗均采用國際標準化組織 (International Organization for Standardization，ISO) 標準稀釋水、Elendt M4 培養液及Elendt M7 培養液，試驗期間水質穩定，pH 值為6.0～9.0，溶解氧≥ 3.0 mg/L，水的硬度 (以 CaCO3計) 為 140～250 mg/L。

羊角月牙藻 Selenastrum capricornutum，購自中國科學院水生生物研究所。按無菌操作法將試驗用藻接種到裝有培養基的錐形瓶內，置于人工培養箱中培養，每天定時搖動3 次，每隔96 h 接種1 次，反復接種2～3 次使藻基本達到同步生長階段后供試。每次接種時在顯微鏡下檢查藻種的生長情況。試驗環境溫度為20～24 ℃，連續均勻光照，照度為4 440～8 880 lx。

1.3 茶皂素對福壽螺的室內活性測定

本研究中根據殼高 (H) 將福壽螺劃分為3 個等級：幼螺 (8 mm≤H＜15 mm)、中螺 (15 mm≤H＜25 mm) 和成螺 (25 mm≤H＜40 mm)。按 1.15 倍等比配制有效成分質量濃度分別為2.00、2.30、2.65、3.04 和3.50 mg/L，體積為4.5 L 的茶皂素溶液，置于6 L 的塑料儲物箱中。挑選生長良好、螺殼完整的成螺分別置于各濃度儲物箱中進行處理，每箱15 頭。中螺及幼螺組按1.12 倍等比配制有效成分質量濃度分別為1.99、2.22、2.49、2.79、3.13 和3.50 mg/L 的茶皂素溶液，其余均同成螺組。每濃度設3 個重復，并設清水對照。儲物箱上加蓋透氣的塑料蓋，保證透氣的同時防止福壽螺逃逸。分別記錄處理后48、72 及96 h 各組福壽螺的死亡率。福壽螺死亡標準：厴甲打開，螺肉翻出，且觸碰后螺肉不收縮；或厴甲緊閉，用槍頭輕觸即可使螺肉內陷。

1.4 茶皂素對3 種水生生物的安全性評價

1.4.1 茶皂素對斑馬魚的毒性測定 前期測定結果 (見附加材料) 表明，對斑馬魚毒性試驗期間茶皂素濃度均始終高于初始濃度的80%，因而采用靜態法在96 h 內進行斑馬魚安全性評價試驗。按1.04 倍等比配制有效成分質量濃度 (以下同) 分別為 1.95、1.88、1.80、1.73、1.67 和 1.60 mg/L，體積為6 L 的茶皂素溶液，置于10 L 的玻璃缸中。每濃度設3 個重復，并設清水對照，每個重復15 條魚。記錄茶皂素處理后96 h 斑馬魚的死亡率。根據《化學農藥環境安全評價試驗準則》第12 部分的規定[26]，農藥對魚類的毒性等級劃分以96 h 的致死中濃度 (96 h-LC50，mg/L) 值為標準：LC50≤0.1 為劇毒，0.1＜LC50≤1.0 為高毒，1.0＜LC50≤10 為中毒，LC50＞10 為低毒。

1.4.2 茶皂素對大型溞的毒性測定 按1.15 倍等比配制28.00、24.35、21.17、18.41、16.01、12.11 和10.53 mg/L，體積為50 mL 的茶皂素溶液，置于100 mL 的燒杯中。每濃度設6 個重復，并設清水對照，每個重復5 只溞。于試驗開始后48 h 觀察并記錄每個燒杯中溞活動受抑制數。大型溞活動受抑制標準為：輕微晃動容器，溞在15 s內不能游動，但允許其附肢微弱活動。根據《化學農藥環境安全評價試驗準則》第13 部分[27]，農藥對溞類的毒性等級劃分以48 h 的半數抑制濃度(48 h-EC50，mg/L) 值為標準：EC50≤0.1 為劇毒，0.1＜EC50≤1.0 為高毒，1.0＜EC50≤10 為中毒，EC50＞10 為低毒。

1.4.3 茶皂素對羊角月牙藻的毒性測定 根據《化學農藥環境安全評價試驗準則》第14 部分[28]，設置茶皂素上限試驗終濃度為有效成分100 mg/L。配制50 mL、200 mg/L 的茶皂素溶液，置于250 mL錐形瓶中，加入50 mL 羊角月牙藻，輕搖混勻。共6 個重復，并設清水對照。于處理后72 h 通過分光光度計測定羊角月牙藻的吸光度值。根據該準則規定，農藥對藻類的毒性等級劃分以72 h-EC50值 (mg/L) 為標準：EC50≤0.3 為高毒，0.3＜EC50≤3.0 為中毒，EC50＞3.0 為低毒。

1.5 茶皂素對福壽螺的田間藥效試驗

試驗田位于中國福建省南平市邵武市洪墩鎮水口寨村，在單季稻田水稻苗移栽后10 d (2019年6 月3 日至7 日) 進行。共設6 個處理 (均為有效成分用量)：茶皂素2.03、2.25 和 2.48 kg/hm2，50% 殺螺胺乙醇胺鹽WP 0.57 kg/hm2，6% 四聚乙醛GR 0.45 kg/hm2以及清水對照。每個小區面積為666.7 m2，每處理設3 個重復小區，隨機區組排列。用藥前圍修田埂，加高田埂高度，防止水串流。采用Z 字形取樣方法，分別調查施藥前福壽螺活螺數和施藥后2 d 及4 d 的死螺數和活螺數。死亡標準同1.3 節室內活性試驗。

1.6 數據處理

采用Polo Plus version 2.0 軟件計算茶皂素對福壽螺和3 種水生生物的LC50值、致死中濃度比率 (LCR50)、EC50值、卡方值和斜率。茶皂素和兩種對照藥劑 (殺螺胺乙醇胺鹽和四聚乙醛) 對福壽螺的田間藥效采用蟲口減退率和校正防效進行評價，計算公式分別見式 (1) 和式 (2)。校正防效不同處理間的差異顯著性采用IBM SPSS Statistics 21.0 平方根反正弦轉換后再進行分析：不同處理間相同天數的校正防效差異采用方差分析，同一處理2 d 與4 d 之間的校正防效差異則采用獨立樣本t 檢驗分析，差異顯著水平為 p ＜ 0.05。

式中，P 為蟲口減退率 (%)；Nck為藥前活螺數；Nt為藥后活螺數；EC 為校正防效 (%)；Pt為處理組蟲口減退率；Pck為對照組蟲口減退率。

2 結果與分析

2.1 茶皂素對福壽螺的室內活性

試驗結果 (表1) 表明：茶皂素對福壽螺具有良好的室內活性，處理48 h 后即可對福壽螺產生毒殺作用，至96 h 死亡率趨于穩定；且其殺螺活性除受茶皂素濃度影響外還受福壽螺個體大小影響，其中，中螺對茶皂素最敏感。

表1 茶皂素對福壽螺的96 h 室內活性Table 1 Molluscicidal activity of tea saponin after the treatment for 96 h against P. canaliculata in the lab

2.2 茶皂素對3 種水生生物的安全性

前期采用高效液相色譜法檢測的結果證明，茶皂素在水中的實測濃度與理論濃度一致，故在評價茶皂素對3 種水生生物的安全性時皆用理論濃度替代 (附加材料中表3)，并且整個試驗期間茶皂素的最高及最低濃度均高于初始濃度的80% (附加材料中表4、表5 和表6)。同時在試驗前還進行了儀器精密度及重復性等驗證，結果表明儀器精密度和重復性均較好，符合要求 (附加材料中表 1 和表 2)。

根據農藥對魚類、溞類及藻類的毒性等級劃分標準，茶皂素對斑馬魚為中等毒性、對大型溞為低毒 (表2)，對羊角月牙藻為低毒 (表3)。并且有效成分質量濃度為100 mg/L 的茶皂素還可促進羊角月牙藻生長，與對照相比，茶皂素處理72 h后羊角月牙藻細胞密度增加了21%，且該結果具有良好的重復性 (表3)。

表2 茶皂素對斑馬魚和大型溞的急性毒性等級 (n = 3)Table 2 Toxicity of tea saponin against B. rerio and D. magna (n = 3)

表3 茶皂素對羊角月牙藻的72 h 急性毒性等級 (n = 6)Table 3 Toxicity of tea saponin to S. capricornutum after the treatment for 72 h (n = 6)

2.3 茶皂素對福壽螺的田間防效

由表4 可知，在有效成分 2.03～2.48 kg/hm2用量下，茶皂素施用后2 d 和4 d 對福壽螺的田間防效均在90% 以上，與 50% 殺螺胺乙醇胺鹽WP 0.57 kg/hm2和 6% 四聚乙醛 GR 0.45 kg/hm2的防效相當，且3 種藥劑處理后相同時間及同種藥劑處理后不同時間的校正防效均無顯著差異。

表4 不同藥劑對福壽螺的田間防治效果Table 4 Field control efficacy of different pesticides against P. canaliculata

3 結論與討論

茶皂素作為一種植物源農藥，已被證明具有良好的殺螺效果。本研究室內殺螺活性試驗也表明，茶皂素對福壽螺有良好的毒殺作用，且毒殺效果受福壽螺個體大小影響，其中對中螺殺螺活性最高。賢振華等發現，茶皂素的殺螺活性隨著螺齡的增大而降低[25]。本研究結果與之有所不同。目前關于茶皂素對福壽螺作用方式的報道較少，現有文獻表明，福壽螺體內含有大量消化酶，其中纖維素酶含量較為豐富，在離體條件下，低濃度茶皂素對內切β-1,4 葡聚糖酶具有激活作用，高濃度時則對其有一定的抑制作用，而對外切β-1,4 葡聚糖纖維二糖水解酶表現為激活作用[29]。據此推測，茶皂素對不同螺齡福壽螺的活性差異可能與福壽螺攝入水中茶皂素的量及其纖維素酶的活性有關。

對茶皂素進行安全性評價可為其合理使用提供科學指導。本研究結果表明，茶皂素對斑馬魚為中等毒性，這與朱全芬等[30]的研究結果一致。茶皂素對魚的毒性作用主要是由于其對血紅細胞的溶血作用所致，但是其對白細胞卻無影響，所以茶皂素對魚有毒，而對蝦無毒。因此，在田間應用中，應嚴格控制稻田水的排放時間，待茶皂素徹底降解后再排水。相較于茶皂素，殺螺胺和殺螺胺乙醇胺鹽對水生生物的安全性較差。修瑞琴等[31]的研究表明，殺螺胺對斑馬魚的96 h-LC50值為0.52 mg/L，對大型溞的48 h-EC50值為0.38 mg/L，其分別按照1996 年中國環保局關于魚類毒性的分級標準對斑馬魚進行毒性等級劃分，按照化學品毒性分級標準對大型溞進行毒性等級劃分，認為殺螺胺對斑馬魚和大型溞均為劇毒。戴建榮等[32]的研究也表明，殺螺胺和殺螺胺乙醇胺鹽對斑馬魚的毒性較高，96 h-LC50值分別為0.210 4 mg/L 和0.095 4 mg/L。四聚乙醛對水生生物則相對安全，俞麗玲等[33]研究發現，40%四聚乙醛懸浮劑高濃度 (125.5 mL/L) 處理下，鯽魚、白鰱魚、花鰱魚和草魚連續10 d 的死亡率均為0，但尚未見關于四聚乙醛對其他水生生物毒性的研究報道。本研究中，茶皂素雖然對羊角月牙藻和大型溞低毒，但對斑馬魚卻表現為中等毒性。因此，后續應分析茶皂素的降解動態，明確其降解特性，全面評估其應用風險，以便進一步為田間應用茶皂素防控福壽螺提供依據。

田間試驗結果表明，茶皂素對福壽螺的田間防效良好，在有效成分2.03、2.25 和2.48 kg/hm23 種劑量下，其防效無顯著差異，因此，考慮到防治成本，推薦2.03 kg/hm2作為茶皂素防控福壽螺的田間使用劑量。Jia 等[34]研究發現，同樣來源于油茶種子的4% 螺威 (皂素含量為4%) 在室內和田間條件下對釘螺 Oncomelania hupensis、亞歷山大雙臍螺 Biomphalaria alexandrina 和截形小泡螺Bulinus truncates 均有良好的毒殺效果，對日本鵪鶉 Coturnix japonica (7 d-LD50＞ 60 mg/kg) 和淡水蝦 Macrobrachium nipponense (96 h-LC50= 6.28 mg/L)毒性較低，但對斑馬魚高毒 (96 h-LC50= 0.15 mg/L)，這可能是由于4% 螺威的化學結構 (分子式為C50H82O24) 與茶皂素存在差異所致 (茶皂素為混合物，存在多種分子結構，分子式包括C58H90O26、C58H92O25、C59H92O26及 C60H94O27等[35])。

綜上所述，茶皂素生物活性高，具有良好的殺螺效果，且選擇性較強，對非靶標生物相對安全，因此具有較好的開發應用前景。有關其殺螺機理及對其他環境生物的安全性都還有待進一步深入研究。