甲酸與雙甲脒對意大利蜜蜂的時間-劑量-致死率分析

苗春輝, 楊 娟, 黃新球, 荀利杰, 胡宗文

(云南省農業科學研究院 蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101)

蜜蜂 (如意大利蜜蜂、中華蜜蜂) 作為一種主要的授粉性昆蟲，對農業增產、農民創收具有重要作用，同時對于維護生態系統的生物多樣性具有重要而深遠的意義[1-2]。對于意大利蜜蜂而言，其最大的威脅源于體表寄生螨的危害[3]。目前防治蜂螨的方法有多種，如使用殺螨劑、改變溫度及氣壓、割除雄蜂脾等，然而化學殺螨劑的頻繁使用不僅有可能污染蜂產品，并且使得害螨的抗藥性問題日益加重，因此蜜蜂殺螨劑的安全性越來越受到關注[4]。

甲酸是一種有機酸，同時也是蜂蜜中的天然成分，但對蜂螨有很強的刺激作用，于20 世紀80 年代在德國最早被嘗試用于防治蜂螨，后普及到全球蜂業治螨[5]。雙甲脒又稱N,N-雙 (2,4-二甲苯亞氨基甲基) 甲胺 (amitraz)，為常見的有機氮類殺螨劑，廣泛用于農作物上害螨和蚜蟲、棉鈴蟲等害蟲的防治，因對蜜蜂體表寄生螨雅氏螨Varroa jacobsoni 和狄氏螨Varroa destructor 有良好的觸殺效果，且對蜜蜂低毒，因此也被廣泛用于蜂群殺螨[6]。有關甲酸和雙甲脒的殺螨效果在國內有諸多文獻介紹[7-8]，而國外更多關注的則是其對蜜蜂的安全性及生理、病理學影響。Semkiv 等連續兩年觀測發現，波蘭蜂場使用雙甲脒后其在巢脾上的累計殘留檢出率高達94.6%[9]。Gregorc 等采用DNA 檢測的末端轉移酶標記 (TUNEL) 技術，檢測了經雙甲脒處理的蜜蜂幼蟲，發現48 h 后有36% 的3 日齡蜜蜂發生了中腸上皮細胞死亡[10]；同樣，他們采用質量分數為2.97%的甲酸與31.95%的蔗糖混合后處理蜜蜂幼蟲，40 h 后發現有18%的3 日齡蜜蜂發生了上皮細胞死亡，到5 日齡時這一比例增加到82%[11]。

甲酸和雙甲脒對蜂螨的致死效果及對蜜蜂的生理影響均已得到很好的驗證，但兩種殺螨劑對蜜蜂的致死規律還鮮有報道。在國內的養蜂生產中，常將甲酸和雙甲脒配制成一定濃度的溶液后向蜂群噴灑以防治蜂螨[12-13]，而蜜蜂自身的清潔行為會促使工蜂之間相互舔舐而攝入殺螨劑，從而對蜜蜂產生胃毒作用[14]。隨著殺螨劑的廣泛使用，蜂螨已對常規濃度 (1 mL 殺螨劑 : 1 000 mL水，大致相當于質量濃度 1 μg/mL) 的化學類殺螨劑[如氟胺氰菊酯 (fluvalinate，螨凈)]產生了抗藥性[6,15-16]，必須加大濃度才能達到所需的殺螨效果，但有關高濃度下殺螨劑對意大利蜜蜂的影響尚未見報道。為此，本研究采用時間-劑量-致死率(time-does-mortality，TDM) 模型，研究了甲酸與雙甲脒對意大利蜜蜂成年工蜂的致死規律，以期掌握甲酸和雙甲脒對意大利蜜蜂的致死動態及時間-劑量效應，旨在為田間合理應用這兩種藥劑提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

蜂群：6 群意大利蜜蜂 Apis mellifera 飼養于云南農業科學院蠶桑蜜蜂研究所意大利蜜蜂試驗蜂場內，待工蜂出房后進行標記，采集蜂箱內21 日齡的成年工蜂供試。

主要儀器：蜜蜂飼養盒[20 cm × 6 cm × 3.5 cm的木質盒，內含有 5 個飼養室 (6 cm × 3.5 cm × 3.5 cm)，每個飼養室前面有門檔，后面為孔徑1 mm 的鐵紗網]；WYA-2 S 型數字阿貝折射儀 (上海物光科技開發有限公司)。

藥劑：甲酸 (formic acid) 和雙甲脒 (amitraz)原液由浙江商貿浙雨試劑公司提供，分析純，以質量分數30%的蔗糖液作為溶劑，按表1 配制成梯度濃度藥液，并以30%蔗糖液作為空白對照。將配制好的藥液置于50 mL 離心管內，于5 ℃保存，在試驗開始前1 h 取出，于室溫下放置，待試驗時搖勻飼喂。麻醉用CO2(蒙自市黃龍氧氣供應站提供，裝于CO2鋼瓶中，通過鋼瓶閥門控制CO2流量)。

1.2 試驗方法

蜜蜂捕捉：于試驗開始前21 d 在蜂群內標記剛出房蜜蜂，為0 日齡，以獲得同一日齡工蜂。為防止蜜蜂捕捉過程中受傷，采用CO2麻醉后用鑷子和吸管小心捕捉，置入飼養盒中。共設12 個蜜蜂飼養盒，每盒含5 個飼養室，即總計60 個獨立的飼養室，每個飼養室放入20 只蜜蜂，以獲得每個濃度藥劑3 次重復。

饑餓處理：為剔除在捕捉過程中致死的蜜蜂，待被麻醉的蜜蜂蘇醒后，靜置饑餓處理2 h，用鑷子觸及蜜蜂軀體而不活動者判定為死亡，清理并記錄死亡蜜蜂數。

表1 兩種供試藥液濃度梯度Table 1 The concentration gradient of acaricide

飼喂處理：采用攝入法處理蜜蜂[14,17]。為準確記錄蜜蜂取食藥量，采用移液槍每隔6 h 飼喂1 次。將1 000 μL 移液槍調到最大量程，吸取藥液后將槍頭傾斜45° 角對準蜜蜂聚集區，輕輕旋轉排量按鈕，使在槍頭形成藥滴飼喂蜜蜂，至蜜蜂不再取食后移出，移液槍最大量程與此時刻度的差值即為蜜蜂取食藥量。每濃度重復3 次。當每個飼養室蜜蜂死亡數量 ＞10 只時，改用100 μL的移液槍進行飼喂。每次飼喂前記錄蜜蜂的死亡數，并清理已死亡的蜜蜂。

1.3 數據統計與分析

數據以Excel 2012 軟件進行收集整理和作圖，采用DPS 軟件對殺螨劑毒殺活性試驗結果進行TDM (Time-Does-Mortality) 模型模擬和時間-劑量效應參數估計[18]，采用Pearson 卡方檢驗和Hosmer-Lemoshow 檢驗對所建立的模型擬合度進行驗證，以評價兩種殺螨劑對蜜蜂的毒性作用。

TDM 模型因其數學結構也可稱為互補重對數模型，其給出了某供試生物在任意時間tj(j = 1, 2,3, ···, J ) 下經藥劑 (被供試因子) 劑量 di(i = 1, 2,3···, I ) 處理后的累計致死率 (cumulative mortality probability)[19]，其計算公式見式1。

式中：待估參數β 可描述為 “假設存在的每個關鍵生物受體所接受活性分子的平均數目”，即劑量效應的斜率；τj描述截止于時間tj時的待估時間效應參數。τj+ βlgdi與 ln[?ln (1?Pij)]具有線性關系，稱為線性預測因子 (linear predictor)。

累計致死率是連續性時間變量的非獨立性變量，因而，式1 并不能滿足模型模擬的獨立性假設。若時間區間[tj?1, tj]非常短，同時各時間段相互獨立，那么劑量di促使試蟲在時間段[tj?1, tj]內發生的死亡率就是時間變量的獨立性變量，可模擬。這個死亡率即條件死亡率 (conditional mortality probability)，是指實際死亡數與供試時間起始的存活數之比，其計算公式見式2。

式中：γj為供試時間區間[tj?1, tj]內時間效應的待估參數。γj和 τj的關系見式 3。

式中， γk 為某一時刻時間效應的待估參數。

2 結果與分析

2.1 意大利蜜蜂死亡趨勢

不同濃度甲酸和雙甲脒處理后不同時間下意大利蜜蜂的累計致死率見圖1。總體而言，累計致死率隨藥劑質量濃度遞增及處理時間的延長而增加。其中，目前田間所用質量濃度 (1.67 μg/mL)的甲酸和雙甲脒對意大利蜜蜂的累計致死率迅速增加的時間始于處理后6 h，分別在處理后60 h和42 h 達到死亡率高峰，累計致死率超過50%的時間 (T50值) 分別為處理后12 h 和18 h，顯著高于推薦使用質量濃度 (1 μg/mL) 下甲酸和雙甲脒的累計致死率 T50值 (分別為 27 h 和 24 h，P甲酸= 0.043，df = 18，P雙甲脒= 0.032，df = 18)。劑量≥5 μg/mL時，在處理后30 h 內累計致死率達最高，T50小于9 h。低于1 μg/mL 時，兩種藥劑累計致死率隨處理時間變化的趨勢相近。結合各處理的累計致死率和處理時間看，濃度變化對累計致死率的影響程度次序為雙甲脒＞甲酸。

2.2 TDM 模型模擬

兩種藥劑的處理時間效應和劑量參數比較見表2。經t 檢驗，兩種藥劑的劑量效應與時間效應均極顯著 (P ＜ 0.01)，即相對于參數估計值標準誤均極小。條件死亡率是時間的相關函數，τj描述截止時間tj的待估時間參數，β 為劑量效應的斜率。甲酸與雙甲脒的劑量效應斜率β 分別為1.98和2.44，即意大利蜜蜂工蜂對兩種藥劑濃度變化的敏感性為雙甲脒＞甲酸。時間效應參數γj估計值表明，相同時間點下雙甲脒的時間效應參數均高于甲酸，并且甲酸的持續時間短于雙甲脒。模型擬合結果與試驗結果 (圖1) 相符。

通過TDM 模型擬合優度的顯著性可以檢驗建模是否成功，若差異顯著則表明建模成功。從表3可看出，本研究的數據符合TDM 模型，Pearson卡方檢驗和Hosmer-Lemoshow 擬合異質性檢驗顯著水平均＜0.05，表明模型的擬合異質性能夠描述兩種藥劑的時間-劑量效應關系。

2.3 兩種藥劑的劑量效應

甲酸和雙甲脒處理意大利蜜蜂工蜂后不同時間的劑量效應模擬結果見圖2。隨著處理時間延長，達到同等致死效應所需的藥劑濃度呈遞減趨勢，即甲酸和雙甲脒對意大利蜜蜂工蜂的LD50和LD90值與處理后時間的對數呈負相關函數關系，處理后 66 h 的 LD50和 LD90值分別為 7.40 × 10?2、2.99 × 10?2μg/mL 和 4.21 × 10?2、2.60 × 10?2μg/mL。處理12 h 后蜜蜂死亡率趨于平穩，表明在處理后12 h 內蜜蜂死亡率偏高，后期則變化較小。從圖2還可看出，甲酸的LD50和LD90值均高于雙甲脒，且兩種藥劑間差異顯著 (P = 0.014，df = 42，t = 0.81)，表明雙甲脒對蜜蜂的毒性強于甲酸。

2.4 時間效應

根據TDM 模型可得出不同濃度甲酸和雙甲脒對意大利蜜蜂的LT50和LT90值 (圖3)。從中可看出，時間效應與處理劑量間呈負相關關系，即隨劑量升高兩種供試藥劑對意大利蜜蜂的致死時間縮短。藥劑的LT50和LT90值越小，表明其毒性越強。從圖3 可知，1 和10 μg/mL 質量濃度下，甲酸和雙甲脒的LT50值分別為4.8、4.2 h 和1.5、1.4 h，差異極顯著 (P = 0.005，df = 7，t = 4.06)，表明雙甲脒對蜜蜂的毒性強于甲酸，與圖2 的結果相似。當質量濃度升至2.5 μg/mL 后，兩種藥劑對蜜蜂的LT50值相當，說明此時兩種藥劑對蜜蜂的毒性相近。

待估參數γj在不同時間區間[tj?1, tj]內條件死亡率與藥劑濃度di的函數關系見式2，其擬合曲線與試驗測定值的關系見圖4。甲酸和雙甲脒條件死亡率迅速遞增的線性預測因子為 ?0.1～0.1，通過比較擬合曲線的系數及R2值可知，甲酸的擬合曲線二項式系數為1.493 1，R2為0.518 7，雙甲脒的擬合曲線二項式系數為2.285 1，R2為0.678 7，即雙甲脒的擬合曲線二項式系數和R2值均高于甲酸，同樣表明兩種藥劑的毒性順序為雙甲脒＞甲酸。

表2 甲酸和雙甲脒對意大利蜜蜂的TDM 模型模擬和時間-劑量效應參數估計Table 2 Time- and dose- effect parameter estimated from the time-does-mortality data of formic acid andamitraz on the honeybees, Apis mellifera

表3 TDM 模型擬合優度Table 3 Goodness fitness of TDM model

3 討論與結論

在評價藥劑生物活性的參數中，劑量效應和時間效應是重要的指標之一[20]。TDM 模型能夠充分揭示劑量效應和時間效應的關系，合理表達時間-劑量相互作用關系，并且直觀地展示藥劑致死的動態變化、高峰期、致死劑量等指標[21]，在評價藥劑的毒力、害蟲敏感程度及致死率變化等方面有著顯著的優勢[22]。楊振國等[23]采用TDM 建模，通過Hosmer-Lemoshow 擬合異質性檢驗，證明了植物源類殺螨劑的數據分析能夠無偏差地描述時間-劑量-致死率的相互關系。本研究中TDM模型的擬合異質性 (表2) 檢驗同樣能夠描述兩種藥劑對意大利蜜蜂的時間-劑量-致死率相互關系。

甲酸和雙甲脒作為常用的殺螨劑，對意大利蜜蜂體表寄生螨，尤其是狄斯瓦螨 (大蜂螨) 有著良好的觸殺和防治效果[5,7-8,10-11]，但在防治蜂螨的同時也會對意大利蜜蜂產生毒殺效應。本研究中，兩種藥劑處理后對意大利蜜蜂的累計致死率隨藥劑質量濃度遞增及處理時間的延長而遞增：≥5 μg/mL 時，在處理后30 h 內累計致死率均達100%；低于 1 μg/mL 時，兩種藥劑的累計致死率隨處理時間變化的趨勢相近 (圖1)，且在劑量效應中甲酸的LD50和LD90值均高于雙甲脒 (圖2)，以及在時間效應 (圖3) 中甲酸和雙甲脒在1 和10 μg/mL處理后的LT50值分別為4.8、4.2 h和1.5、1.4 h。研究表明，相同濃度下雙甲脒的作用時間較短，毒性較強，依據各處理的累計致死率和處理時間，表明濃度變化對意大利蜜蜂的影響程度次序為雙甲脒＞甲酸。

劑量效應的斜率β 描述了假設存在的每個關鍵生物受體所接受的活性分子的平均數，可表示為殺蟲劑對昆蟲的毒力參數[24-25]。最早報道多種殺蟲劑對昆蟲的毒力參數估計范圍的是Preisler等[21]，為1.4～3.5。本研究中甲酸與雙甲脒的劑量效應斜率β 值分別為1.98 和2.44，表明甲酸對意大利蜜蜂的毒性與常用化學殺蟲劑雙甲脒相當。TDM 模型劑量效應參數能充分證明生物測定數據的完整性和客觀性，對生物測定有重要的理論和實踐價值，在姜靈等[26]及王艷秋等[27]檢測真菌類生物制劑殺蟲效果的研究中均得到了很好的驗證。本研究中，TDM 模型也可較好地反映出甲酸與雙甲脒對意大利蜜蜂的致死效應。

在實際生產中，為使效果最大化，養蜂員常將甲酸和雙甲脒藥液霧化后再進行噴施[8,13,28]，以擴大藥劑在蜂箱內的擴散范圍，但因此也增大了成年工蜂因清潔行為舔舐攝入殺螨劑的風險。目前多數殺螨劑使用說明書的推薦濃度均為1 mL 殺螨劑 : 1 000 mL 水 (大致相當于質量濃度 1 μg/mL)[8]，但在實際使用中往往高于該濃度。從本研究結果(圖1) 看，1.67 μg/mL 甲酸和雙甲脒處理的累計致死率T50值分別為處理后12 h 和18 h，顯著高于推薦質量濃度的累計致死率T50值 (分別為27 h和24 h)，因此在田間使用甲酸和雙甲脒防治意大利蜜蜂的狄斯瓦螨時，綜合考慮殺螨劑對蜜蜂的致死率及對蜂螨的殺滅效果，建議藥劑質量濃度最高不宜超過 1.67 μg/mL 。