江西省番茄綿疫病菌對嘧菌酯的敏感性檢測及抗性風險分析

何烈干, 鄒 芬, 李湘民, 黃瑞榮, 馬輝剛

(江西省農業科學院 植物保護研究所，南昌 330200)

番茄綿疫病，又稱褐色腐敗病、番茄掉蛋，是由寄生疫霉Phytophthora parasitica Dast、辣椒疫霉Phytophthora capsici Leonian 或茄疫霉Phytophthora melongenae Sawada 引起的一種卵菌病害[1-2]。該病在世界各地均有分布，一般田塊可導致減產30%～40%，重病田可達60%以上，甚至絕收，經濟損失嚴重[3-5]。番茄為江西主栽蔬菜之一，近年來種植面積大幅增加，但在每年5—6 月份的豐水季節，綿疫病常暴發流行，發生面積數萬公頃，產量損失達35%以上 (文獻數據來源于地方農業局)。因生產上缺乏有效抗病品種，目前化學防治仍是防治該病的最主要措施[6]。長期以來，甲霜靈一直是防治綿疫病等卵菌病害的特效藥劑，但疫霉菌等易對其產生抗藥性，部分地區疫霉菌已對該藥產生了抗藥性[7-10]，因此，近年來轉而使用其他類型的殺菌劑來防治該病害。嘧菌酯是先正達公司根據天然產物strobilurins A 仿生合成的一種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，其作用機制是通過抑制細胞色素b 和c1 之間的電子傳遞而阻止細胞的ATP 合成，從而抑制其線粒體呼吸而發揮殺菌作用[11]。嘧菌酯殺菌活性高、殺菌譜廣、持效期長、高效低毒，對卵菌病害具有良好的殺菌活性[12-14]，但由于其作用位點單一，因此，病原菌對其易產生抗性[15]。目前國內外尚未見有關番茄綿疫病菌對嘧菌酯的敏感性報道。為掌握番茄綿疫病菌對該藥抗性現狀，本研究測定了番綿疫病菌對嘧菌酯的敏感性，并對其抗性風險進行分析，以指導田間科學用藥和殺菌劑抗性管理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試培養基

10% V8 培養基：將100 mL V8營養汁、0.2 g CaCO3、900 mL 去離子水和18 g瓊脂粉置于三角瓶中，搖勻，在121 ℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min。待冷卻至60 ℃時倒入培養皿中。

選擇性培養基：待上述培養基冷卻至50 ℃左右時，加入利福平20 mg、氨芐青霉素200 mg 和制霉菌素100 mg，混勻，倒入平皿中。

1.1.2 供試菌株 于2018—2019 年在江西于都、安義、萬載、瑞昌、余江、貴溪和樂平等番茄主產區的綿疫病重發田塊采集典型病果，先用自來水沖洗3 min，再用滅菌水沖洗。在病健交界處切取0.5 cm × 0.5 cm 方形小塊，經75%酒精和3%次氯酸鈉消毒后置于選擇性培養基上。待形成微小菌落后，在其邊緣切取菌絲塊，移入不含抗菌素的10% V8 培養基中培養。如此重復3 次，得到純培養物。共分離純化得到58 株菌株，根據形態學特征和ITS 測序結果，鑒定病原菌均為辣椒疫霉Phytophthoracapsici Leonian。將菌株轉接至試管斜面上，加入滅菌石蠟油覆蓋菌面，在10 ℃左右避光保存備用。菌株命名采用地名漢語拼音首字母+序號，如YX1 表示永新地區1 號菌株。

1.1.3 試驗藥劑 96% 嘧菌酯 (azoxystrobin)原藥，由先正達 (蘇州) 作物保護有限公司提供。試驗時先用少許丙酮溶解并配制成質量濃度為100 μg/mL 的母液，待10% V8 培養基溶化后，并冷卻至50 ℃時，加入適量母液，充分振蕩搖勻后倒入培養皿中，即制得含梯度濃度藥劑的平板。

1.2 試驗方法

1.2.1 辣椒疫霉對嘧菌酯的敏感性檢測 采用菌絲生長速率法[16]測定番茄辣椒疫霉對嘧菌酯的敏感性。先進行預備試驗，將供試菌株活化后轉接到含 0、0.1、1、10、100 μg/mL 嘧菌酯的 10%V8 培養基中，25 ℃黑暗培養7 d 后，根據菌絲生長情況將嘧菌酯質量濃度梯度設置為0.05、0.15、0.45、1.35 和4.05 μg/mL，以不加農藥作為對照。在菌落邊緣打取直徑5 mm 的菌餅，菌面朝下置于含系列質量濃度嘧菌酯的培養基平板中央。每處理重復3 次。在生化培養箱中于25 ℃黑暗培養5～7 d，當對照中菌落直徑達到7 cm 以上時，用十字交叉法測量各處理的菌落增長直徑，計算抑制率。將抑制率轉化成幾率值，求出毒力回歸方程y = a + bx，根據毒力回歸方程計算有效抑制中濃度 (EC50) 和相關系數 (r)。

1.2.2 抗性突變體的獲得及抗性水平的測定 將敏感菌株YD5 在10% V8 培養基上于25 ℃下培養7 d 后，在黑暗條件下，將菌落置于距紫外燈 (20 W、波長254 nm) 下方約20 cm 處照射120 s，保持菌落處于黑暗環境中60 min, 以降低光修復。用直徑為5 mm 的打孔器在菌落邊緣迅速打取菌餅，轉接至含10 μg/mL 嘧菌酯的10% V8 培養基上，立即置于恒溫培養箱中于25 ℃下黑暗培養，能夠迅速生長的為疑似突變體。將這些疑似突變體轉移到不含嘧菌酯的10% V8 培養基上活化培養3 代，轉接至含 10 μg/mL 嘧菌酯的 10% V8 培養基上驗證其抗藥性。將各抗性突變體轉接至含不同質量濃度嘧菌酯的10% V8 培養基上培養，計算藥劑對菌絲生長的抑制率 (%)，并求出毒力回歸方程y = a + bx 和 EC50值 (μg/mL)。

根據各突變體的EC50值與其親本菌株 (YD5)的比值計算抗性倍數，根據抗性倍數將各突變體的抗性水平劃分為敏感、低抗、中抗和高抗[17]，其中：抗性倍數≤3 的為敏感菌株 (S)；3＜抗性倍數≤10 的為低抗菌株 (LR)；10＜抗性倍數≤100 的為中抗菌株 (MR)；100＜抗性倍數的為高抗菌株(HR)。

1.2.3 突變體的抗性遺傳穩定性 將抗性突變體轉接到無藥10% V8 培養基上連續轉代培養8 代后，分別計算各突變體第2 代、第4 代、第6 代和第8 代對嘧菌酯的抗性倍數，根據其抗性倍數的變化情況，分析抗藥性狀在無藥劑選擇壓力下的遺傳穩定性。

1.2.4 抗性突變體的生物學性狀

致病力：待抗性突變體和敏感菌株在10%V8 培養基上黑暗培養7 d 后，收集游動孢子制成每毫升含104個游動孢子的懸浮液，采用葉片噴霧法于番茄苗期5～6 葉時接種。單個菌株接種10 株，重復3 次。接種后24 h 內保持相對濕度100%、黑暗和25 ℃；此后保持相對濕度75%以上、光暗交替和25～28 ℃。7～9 d后調查病情，比較敏感菌株和突變體的致病力差異。

生長速率及產孢量：在抗性突變體和敏感菌株的菌落邊緣打取直徑5 mm 的菌餅，菌面朝下置于10% V8 培養基上于25 ℃下黑暗培養，每隔2 d 測量菌落直徑，計算菌株平均生長速率。培養7 d 后用無菌水洗下孢子囊，置于4 ℃冰箱中預冷30 min，促使游動孢子充分釋放，用血球計數板測定各菌株的游動孢子量。

孢子萌發率：將相同濃度的抗性突變體和敏感菌株的游動孢子懸浮液 (1 × 104個/mL) 100 μL均勻涂布于水瓊脂培養基上，23 ℃培養24 h 后，在顯微鏡下觀測每個處理的休止孢子，共觀察10 個視野，計算孢子萌發率。

1.2.5 交互抗藥性測定 采用菌絲生長速率法[18]，測定敏感菌株YD5 及其突變體對烯酰嗎啉和甲霜靈的敏感性 (EC50)，分析嘧菌酯抗性突變體對烯酰嗎啉和甲霜靈是否有交互抗性。

2 結果與分析

2.1 病原菌對嘧菌酯的敏感性

測定了2018—2019 年從江西各地采集分離到的58 個辣椒疫霉菌株對嘧菌酯的敏感性。結果(表1) 表明：嘧菌酯對辣椒疫霉菌絲生長有較強的抑制作用，其 EC50值介于 0.186 7～1.623 9 μg/mL之間，平均 EC50值為 (0.860 6 ± 0.331 8) μg/mL，EC50值最高值與最低值相差8.7 倍，菌株群體對嘧菌酯的敏感性差異不顯著。從EC50值地理分布看，萬載菌株平均EC50值最高，達1.022 2 μg/mL，其次為安義，平均EC50值為0.924 0 μg/mL，瑞昌和于都的最低，平均 EC50值分別為0.739 8 μg/mL和0.737 4 μg/mL，地區間差異較小。

表1 江西辣椒疫霉對嘧菌酯的敏感性Table 1 Sensitivity to azoxystrobin of Phytophthora capsici in Jiangxi Province

對所測58 個菌株的EC50值進行階段分布劃分，統計每個階段內菌株分布的數目及頻率。結果顯示 (圖 1)，EC50值在 0.15～0.45、＞0.45～0.75、＞0.75～1.05、＞1.05～1.35 和＞1.35～1.65 μg/mL 的菌株數分別為 6 株、15 株、21 株、12 株和4 株，分別占樣本總數的10.34%、25.86%、36.21%、20.69% 和6.90%。從圖中可以看出，58 個菌株對嘧菌酯的敏感性頻率分布呈單峰曲線，接近正態分布，未出現抗藥性亞群體，因此，本次測定的病原菌對嘧菌酯的平均EC50值(0.860 6 ± 0.331 8) μg/mL，可作為江西省辣椒疫霉對嘧菌酯的敏感性基線。

2.2 抗性突變體的獲得及抗性水平

通過紫外線照射敏感菌株YD5 (EC50值接近敏感基線) 120 s 后，從20 000 個菌餅中獲得4 個抗性突變體 (YD5-1、YD5-2、YD5-3 和 YD5-4)，突變頻率僅為0.02%，說明江西辣椒疫霉對嘧菌酯產生抗性變異的頻率較低。

菌絲生長速率法測定的抗性突變體在含系列質量濃度 (0、1、2、5、20、10 和 20 μg/mL) 嘧菌酯V8培養基上的生長量結果見表2。4 個突變體的 EC50值在 4.452 1～7.812 1 μg/mL 之間，抗性倍數介于5.3～9.3 之間，均屬于低抗水平。

表2 辣椒疫霉抗性突變體對嘧菌酯的敏感性Table 2 Sensitivity to azoxystrobin of resistant mutants of Phytophthora capsici

2.3 突變體的抗性遺傳穩定性

經紫外線照射得到的4 個低抗性菌株YD5-1、YD5-2、YD5-3 和YD5-4，在無藥培養基上連續轉代培養8 代后發現，各抗性菌株的抗性水平變化不顯著，抗性倍數均介于3～10 之間，仍為低抗菌株 (表3)，說明上述4 個突變體的抗性能穩定遺傳。

表3 番茄辣椒疫霉突變體對嘧菌酯抗性遺傳穩定性Table 3 Genetic stability of resistance to azoxystrobin in the mutants of Phytophthora capsici

2.4 抗性突變體的生物學性狀

從表4 可以看出：除突變體YD5-4 的致病力低于親本菌株外，其余突變體與親本菌株YD5 的致病力間不存在顯著性差異；突變體YD5-2 的生長速率與親本菌株相當，其余3 個突變體均顯著下降；在產孢量方面，突變體YD5-3 與親本菌株不存在顯著性差異，而突變體YD5-1、YD5-2 和YD5-4 的產孢量顯著低于親本菌株，說明抗藥性產生后其無性繁殖能力有明顯變化；親本菌株與所有抗性突變體的孢子萌發率不存在顯著差異性。

表4 抗藥突變體與親本菌株間生物學性狀比較Table 4 Comparison of biological traits between resistant mutants and their parent

2.5 交互抗藥性

采用菌絲生長速率法測定了敏感菌株YD5及其4 個嘧菌酯抗性突變體對烯酰嗎啉和甲霜靈的敏感性。結果表明，4 個抗性突變體對烯酰嗎啉的抗性倍數為0.8～1.4，對甲霜靈的抗性倍數為0.8～1.3。4 個突變體對烯酰嗎啉和甲霜靈的敏感性表現一定程度的降低或增加，說明嘧菌酯與烯酰嗎啉和甲霜靈之間均不存在交互抗性 (表5)。

表5 突變體和敏感菌株YD5 對烯酰嗎啉和甲霜靈的敏感性比較Table 5 Sensitivity comparison of resistant mutants and susceptible strain YD5 to dimethomorph and metalaxyl

3 結論與討論

本研究結果表明：2018—2019 年從江西省番茄主產區采集分離得到的58 個辣椒疫霉菌株對嘧菌酯仍有較高的敏感性，其對嘧菌酯的敏感性基線為 (0.860 6 ± 0.331 8) μg/mL。58 個菌株的菌絲生長對嘧菌酯的敏感性頻率呈正態分布，田間未出現抗性菌株，這與Emil 等[19]、Qin 等[20]和姜彥全等[21]關于疫霉菌的研究結果相符。鑒于此，目前江西地區仍可使用嘧菌酯防治綿疫病。但辣椒疫霉具有易變異性等特點，長期使用單一藥劑有產生抗藥性的風險，應定期加強田間菌株的抗藥性監測，掌握病原菌的敏感性變化動態，適時制定防治策略。

為評估辣椒疫霉對嘧菌酯的抗性風險，本研究通過紫外線照射敏感菌株，成功誘導出4 個低抗菌株，未獲得中、高抗菌株，抗性突變率為0.02%。對突變體的抗藥性進行遺傳穩定性分析，發現經過8 次轉代培養后，其抗性水平變化不顯著，抗性能夠穩定遺傳，且突變體的致病力與親本菌株不存在顯著性差異，多數突變體的生長速率與產孢量均顯著低于親本敏感菌株，而在孢子萌發率方面兩者不存在顯著性差異。綜上可知，雖然目前生產上江西辣椒疫霉尚未出現抗嘧菌酯菌株，但存在抗性突變體產生的可能性，且這種抗性遺傳很穩定，不易喪失，突變體致病力也不減弱，由此推斷，病菌對嘧菌酯的抗性風險為中等，因此，生產上應該注意對嘧菌酯抗性的管理，應注意輪用或換用作用機理不同殺菌劑。

針對目前生產上常見的交互抗藥性問題，本研究選用生產上防治番茄綿疫病的常規藥劑烯酰嗎啉和甲霜靈與嘧菌酯進行交互抗藥性分析，證實嘧菌酯與烯酰嗎啉和甲霜靈間均不存在交互抗性。郭梁等[22]和李成斌等[23]研究認為，疫霉菌對甲霜靈和嘧菌酯不存在交互抗性；袁善奎等[18]研究表明，疫霉菌對嘧菌酯和烯酰嗎啉無交互抗性。張海良等[24]測定了江西辣椒疫霉菌對甲霜靈的敏感性，結果發現，108 個菌株均為敏感菌株，未出現抗藥性病原菌亞群體，且在生產中甲霜靈對卵菌病害防效較為顯著。因此，建議生產上可將該藥劑與烯酰嗎啉、甲霜靈以及其他作用機理不同的殺菌劑混用或交替使用，以緩解殺菌劑對抗藥性的選擇壓力，延長藥劑的使用期限。