滅蠅胺在茶樹菇及其培養基質中的殘留及消解動態

吳 迪, 矯 健, 尹 碩, 羅雪婷, 潘洪吉,李秋梅, 黃培鑫, 師迎春

(北京市植物保護站，北京 100029)

茶樹菇Agrocybe aegerita 由于其生產特點和栽培方式受局限，是目前尚不能進行工廠化生產的食用菌品種之一，其生產過程中的病蟲害防治，尤其是對菇蚊菇蠅的防治還存在一定的難度。目前，中國在食用菌上登記的殺蟲劑僅有氯氟·甲維鹽乳油1 種[1]，不能滿足生產實際的需要。滅蠅胺 (cyromazine) 屬三嗪類昆蟲生長調節劑[2]，具有強內吸傳導作用，可以誘使雙翅目幼蟲和蛹發生畸變，成蟲羽化不全或被抑制[3]。據報道，滅蠅胺在雙翅目害蟲防治中具有一定優勢[3]，其對潛葉蠅、異型眼蕈蚊和食用菌眼蕈蚊等毒力作用和藥效顯著[3-5]，且對菌絲生長抑制作用較小[6]。目前滅蠅胺在美國、日本等國家在食用菌上均已登記使用[6]。已有研究表明，滅蠅胺在中國的使用尚不會產生不可接受的膳食攝入風險[2,7-8]。筆者調研發現，滅蠅胺在食用菌生產中使用較廣泛，有必要對其在食用菌中使用后的殘留情況進行研究。

中國尚未制定滅蠅胺在食用菌上的最大殘留限量標準 (MRL) 和相關標準檢測方法，CAC (國際食品法典委員會) 規定，滅蠅胺在蘑菇中的MRL值為7 mg/kg[9]，歐盟規定其在栽培真菌和野生菌中的MRL 值分別為10 mg/kg 和0.05 mg/kg[10]，美國規定滅蠅胺在蘑菇中MRL 值為1.0 mg/kg[11]。

關于滅蠅胺殘留的檢測方法主要有液相色譜法[12-14]、液相色譜-質譜聯用法[15-16]、CdSe/CdS 量子點熒光探針法[17]等，但涉及食用菌基質檢測的較少[12]，對茶樹菇中滅蠅胺殘留的研究尚未見報道。雖然有文獻報道三聚氰胺為滅蠅胺的降解產物[2]，但在JMPR 報告中，滅蠅胺的殘留物監測定義和風險評估定義僅為滅蠅胺，不包括三聚氰胺，認為三聚氰胺的毒性比滅蠅胺小，且樣本中的三聚氰胺可能有其他的來源[18-19]。依據該報告，本研究中不對三聚氰胺進行檢測，建立了與相關文獻方法不同的簡單快速的液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS) 測定食用菌中滅蠅胺殘留的分析方法，并基于生產實際中農戶使用滅蠅胺防治菇蚊、蠅的用藥量，對菇棚中滅蠅胺的殘留消解動態及最終殘留進行了研究，旨在為其合理使用和最大殘留限量制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥劑與試劑

Agilent 1260-6460 型三重串聯四極桿液相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫公司；Autogizer 701 型全自動多通道樣品勻質器，美國TOMTEC公司；TG16 型臺式高速離心機，長沙英泰儀器有限公司；FP3010 食物調理機，德國博朗公司。

99.2%滅蠅胺標準品 (cyromazine)，國家農藥質檢中心 (沈陽)；50%滅蠅胺可溶性粉劑 (cyromazine SP)，東莞市瑞德豐生物科技有限公司。

甲醇 (質譜純)，Fisher 公司；氯化鈉 (分析純)，天津市瑞金特化學品有限公司。

1.2 培養基質 (菌棒)

茶樹菇栽培中，使用棉籽皮90%、麩皮5%、豆粕2%和生石灰3% (質量分數) 作為培養基質，裝入塑料袋中形成棒狀，以菌棒形式進行生產。

1.3 田間試驗

供試藥劑為50%滅蠅胺可溶性粉劑。

1.3.1 殘留消解動態試驗 茶樹菇采用菌棒豎放培養，每小區面積5 m2，每小區放置400 個菌棒。施藥劑量為滅蠅胺有效成分3 433.5 g/hm2，待出菇后，噴霧施藥1 次，每小區用藥液量為3 L，重復 2 次。于藥后 2 h 及 1、2、3、5、7、10、14、21、28 d 取茶樹菇和菌棒樣品。

1.3.2 最終殘留試驗 設4 個不同施藥劑量和不同施藥次數的小區，每小區面積5 m2，菌棒數量約550 個，以滅蠅胺有效成分2 289 g/hm2、3 433.5 g/hm2的劑量施藥3、4 次，于田間茶樹菇生產間歇茬口開始施藥，不強調茶樹菇必須著藥，施藥間隔期為7 d。另設不施藥對照區。于末次施藥后3、5、7 和10 d 分別取茶樹菇和菌棒樣品。

1.3.3 取樣方法 茶樹菇樣品按五點法取整株出菇部分，每小區取不少于12 個點，總質量不少于2 kg，用食物調理機打碎，混勻，待分析。

菌棒按五點法整袋取樣，每小區取5 個點。菌棒長度約15 cm，分為上、中、下3 段，每段約5 cm，分別用食物調理機打碎，混勻，待分析。

1.4 樣品前處理

稱取10 g 樣品，加入1.0 mL 水和30.0 mL 甲醇，于12 000 r/min 下勻漿2 min；加入7 g 氯化鈉后劇烈振蕩1 min；移取1 mL 上清液至1.5 mL離心管中，于10 000 r/min 下離心10 min；取上清液過0.22 μm 微孔膜，待測定。

試驗過程中，對初步測定后測定溶液濃度高于線性范圍的樣品，用甲醇稀釋后再測定，以確保測定樣品溶液濃度在線性范圍內。

1.5 儀器分析條件

色譜條件：使用色譜柱為ZORBAX Eclipse plus C18Rapid Resolution HT 3.0 mm × 100 mm 1.8-Mincron 600Bar，柱溫為35 ℃，進樣體積2 μL。流動相A 相為5 mmol/L 醋酸銨 + 0.1%甲酸水溶液，B 相為甲醇，流速為0.4 mL/min。采用梯度洗脫程序，梯度變化見表1。

表1 液相色譜-質譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of LC-MS/MS

質譜條件：電噴霧離子源正離子掃描 (ESI+)，多反應監測模式 (MRM)；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流速7 L/min；霧化氣壓力241.4 kPa；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速11 L /min；毛細管電壓3 KV；噴嘴電壓0 V。多反應監測參數見表2。

1.6 方法學驗證

稱取滅蠅胺標準品0.01 g (精確至0.000 1 g)，用體積分數為0.1%的甲醇水溶液溶解，配成質量濃度為1 000 mg/L 的滅蠅胺標準儲備液，于 ?20 ℃下避光保存。用甲醇稀釋滅蠅胺標準儲備液，配成質量濃度分別為0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.08、0.1 和0.2 mg/L 的系列滅蠅胺標準溶液，外標法定量。以滅蠅胺質量濃度為橫坐標，定量離子峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

表2 滅蠅胺多反應監測參數Table 2 Multi-reaction monitoring parameters of cyromazine

向空白茶樹菇和菌棒中分別添加滅蠅胺標準溶液，添加水平為0.01、0.1 和1 mg/kg，每個水平重復5 次，計算回收率及相對標準偏差 (RSD)。

2 結果與分析

2.1 施藥方式和劑量的選擇

食用菌生產中主要的施藥方式為拌料和噴霧。考慮到噴霧方式直接接觸食用部位，殘留影響更大，故選擇噴霧作為本研究的施藥方式。

鑒于有關滅蠅胺殘留的研究報道較少，文獻數據對本研究的參考價值不大，故在本試驗開展過程中，通過對常年從事茶樹菇生產的基地和生產者進行調研，參照其日常防治用藥量，確定本研究的施藥劑量為滅蠅胺有效成分2 289 和3 433.5 g/hm2。

2.2 樣品前處理方法的優化

分別考察了乙腈、甲醇、V (甲醇) : V (水) = 30 :1 作為提取溶劑對滅蠅胺提取效率的影響。結果表明：當以乙腈或甲醇作為提取溶劑時，滅蠅胺的回收率均較低，在30%～60%之間，不能滿足殘留分析的要求。當以V (甲醇) : V (水) = 30 : 1 作為提取溶劑時，滅蠅胺的回收率為72%～110%，加入過量的氯化鈉，可在一定程度上降低部分大分子雜質在提取液中的溶解度，再高速離心可去除提取液中的懸浮顆粒，達到有效提取和凈化基質中目標分析物滅蠅胺的目的。故最終選擇加水輔助甲醇提取，加入氯化鈉后高速離心凈化的前處理方法。

2.3 方法學考察結果

結果 (表 3) 表明：在 0.002～0.05 mg/L 和 0.01～0.2 mg/L 范圍內，滅蠅胺的質量濃度與對應的峰面積間均呈良好的線性關系，R2≥ 0.997。能夠滿足本試驗定量分析的要求。

按照添加回收的最低濃度確定方法的定量限，則滅蠅胺在茶樹菇和菌棒樣品上的定量限(LOQ) 均為0.01 mg/kg；依據最低濃度的信噪比估算方法檢出限，則滅蠅胺在茶樹菇和菌棒中的檢出限 ((LOD) 均為 0.002 mg/kg。

表3 滅蠅胺的線性范圍、決定系數、檢出限及定量限Table 3 Linear range, coefficient of determination, LOD and LOQ of cyromazine

在0.01、0.1 和1 mg/kg 添加水平下，滅蠅胺在茶樹菇和菌棒中的回收率均在72%～110% 之間，RSD 在2%～6%之間 (表4)，均滿足農藥殘留試驗準則的要求[20]。

表4 滅蠅胺在茶樹菇和菌棒中的添加回收率及相對標準偏差Table 4 Recoveries and RSDs of cyromazine in Agrocybe aegerita and its substrates (n = 5)

2.4 滅蠅胺殘留消解動態

結果 (表5) 表明，滅蠅胺在茶樹菇中的殘留消解規律符合一級反應動力學模型，消解曲線為ct= 0.285e?0.127t(R2= 0.795 7)，半衰期為 5.46 d；菌棒中滅蠅胺殘留集中分布在上段，藥后1～21 d 的殘留量在0.33～0.69 mg/kg 之間，無明顯降低趨勢，且遠高于中段 (0.022～0.091 mg/kg) 和下段(0.017～0.091 mg/kg) 中滅蠅胺殘留量。

由于滅蠅胺通過自上而下噴霧方式施入，在菌棒中逐漸下滲，故上段農藥殘留量明顯高于中、下段，但隨著時間的變化，上、中、下段中滅蠅胺的殘留量比例變化不顯著，這可能與菌棒為半閉體系有關。藥后21 d 內菌棒中的滅蠅胺殘留量無明顯的降低，說明滅蠅胺在菌棒中的殘留時間較長，施藥一次即可滿足茶樹菇一個出菇周期 (約為20 d) 的用藥需求。

2.5 滅蠅胺最終殘留結果

由表6 可知，噴霧施藥后按照茶樹菇正常生長周期進行取樣，滅蠅胺在茶樹菇中的殘留量為0.053～0.18 mg/kg，在菌棒上段殘留量為0.67～1.58 mg/kg，菌棒中段為0.035～0.46 mg/kg，菌棒下段為＜0.010～0.20 mg/kg。可見滅蠅胺殘留主要集中在菌棒的上段。

茶樹菇中滅蠅胺殘留規律：1) 采樣間隔期越長，殘留量越低。2) 施藥劑量越大，殘留量越高。由于最終殘留試驗中在出菇間歇時施藥，故茶樹菇中的滅蠅胺均為自菌棒中內吸傳導所獲得，說明在菌棒中的施藥劑量越大，茶樹菇吸收滅蠅胺的量越大。3) 施藥3 次和4 次處理間的殘留量差異不大，在一定程度上說明視防治需求適當增加用藥次數，可能不會增加茶樹菇中滅蠅胺的殘留風險。4) 最終殘留試驗施藥次數、施藥總量均高于消解動態試驗，但殘留量卻低于后者，說明直接噴施在食用菌表面殘留的滅蠅胺比從基質中吸收的滅蠅胺殘留量高，可以采取在出菇間歇茬口施藥的方式以降低其在食用菌中的殘留量。

表5 滅蠅胺在茶樹菇及菌棒中的消解動態Table 5 Dissipation dynamics of cyromazine in Agrocybe aegerita and its substrates

表6 滅蠅胺在茶樹菇和菌棒上的最終殘留量Table 6 Terminal residues of cyromazine in Agrocybe aegerita and its substrates

菌棒中滅蠅胺殘留規律：1) 滅蠅胺殘留主要集中在上段菌棒中。2) 施藥劑量和施藥次數對菌棒中的殘留量影響不顯著。

3 結論與討論

采用液相色譜-串聯質譜法測定茶樹菇及其菌棒中的滅蠅胺殘留量，方法簡單、快捷，檢出限低，其平均回收率為72%～110%，相對標準偏差為2%～6%。與乙酸銨-乙腈提取、固相萃取凈化等標準方法相比，該方法更加簡便，較相關文獻中乙腈提取后加氯化鈉分層的方法提取效率更高。

消解動態試驗結果表明，滅蠅胺在茶樹菇中的半衰期為5.46 d；滅蠅胺在菌棒中主要分布于上段，且在施藥后21 d 內殘留量無明顯的降低，基本可提供茶樹菇一個出菇周期的持續防效。

最終殘留試驗結果發現，與消解動態試驗結果一樣，滅蠅胺殘留主要集中在菌棒上段。最終殘留試驗中茶樹菇上的滅蠅胺殘留量較菌棒中的殘留量低，且比消解動態試驗中茶樹菇直接著藥的殘留量低。故在實際生產中可將用藥時期控制在未出菇時，既能夠避免茶樹菇直接著藥產生較高殘留，又能對在菌棒中孵化和生長的菇蚊、菇蠅幼蟲進行有效防治。

在食用菌生產中，采取培養基質用藥，一定程度上既能保障相關病蟲害的有效防治，又能降低可食部分的農藥殘留，對食用菌用藥防治方法的改進有實際的意義。

試驗結果表明，按有效成分2 289～3 433.5 g/hm2施藥3～4 次，3 d 后滅蠅胺在茶樹菇中的殘留量在0.10～0.17 mg/kg 之間。結合國際農藥殘留和本研究結果，建議我國規定滅蠅胺在食用菌上的MRL 值為1.0 mg/kg。由于食用菌屬于小宗作物，農藥企業的登記成本較高，雖然用藥需求大，但企業主動登記的積極性并不高，希望有關部門能夠引導農藥企業登記，并積極推動限量標準制定工作，以便更好地指導食用菌生產用藥。

本文選擇目前農藥殘留風險較高的食用菌——茶樹菇作為研究對象，分析其在食用菌上的殘留行為，其栽培方式較為單一，生產主要在棚室內進行，需要對光照、溫度、濕度進行控制，不同試驗點之間的差異性不大。本研究結果是基于北京一個試驗地點的研究數據，雖在一定程度上能夠反映生產實際，但離完全支撐食用菌中農藥殘留限量國家標準的制定尚有一定差距。此外，由于不同的食用菌栽培方式和生長情況差異較大，該研究結果是否在其他食用菌中具有類似的規律，還有待進一步研究證實。在檢測方法方面，本試驗方法雖未能將甲醇提取液與樣本基質中的水完全分離，但由于同類基質中含水量相近，樣本與提取液的結合方式相同，故采取此方法開展研究基本能夠滿足要求。為適應不同基質檢測的需要，其檢測方法有待進一步優化。