灰葡萄孢對腐霉利的抗性分子機制及快速檢測技術

鄭 遠, 沈 瑤, 汪漢成, 戴德江,沈 穎, 吳鑒艷, 張傳清*,

(1. 浙江農林大學 農業與食品科學學院，杭州 311300；2. 浙江省植物保護檢疫與農藥管理總站，杭州 310004；3. 貴州省煙草科學研究院， 貴陽 550081)

由灰葡萄孢Botrytis cinerea 引起的灰霉病是影響草莓產量和質量的主要病害之一[1]。灰葡萄孢能夠侵染草莓植株地上部分的所有器官，包括葉片、花瓣、果實等，其中對果實的危害尤為嚴重[2]，造成的產量損失達1 0%～3 0%，嚴重時高達50%以上，甚至絕棚[3]。目前，化學防治是防治灰霉病的主要手段。腐霉利是一種二甲酰亞胺類殺菌劑 (dicarboximide fungicides，DCFs)，由于其對灰葡萄孢有特效，因此被大量用于果蔬灰霉病的防治[4]，但隨著該藥劑的長期大量、連續使用，灰葡萄孢對其抗性問題也日益嚴重。相關抗性報道已有很多：趙虎等研究表明，江蘇省草莓灰霉病菌對腐霉利的抗性頻率達54%以上[5]；宋晰等研究表明，內蒙古灰霉病菌對腐霉利的平均抗性頻率高達90%以上[6]。然而，腐霉利作為浙江省用于草莓灰霉病防治的主要殺菌劑之一，卻鮮有相關研究報道。因此，明確浙江省草莓灰霉病菌對腐霉利的抗性現狀，對建立合理的用藥策略具有重要意義。

幾種病原菌如灰葡萄孢[7]、鏈格孢Alternaria alternata[8]和粗糙脈孢霉Neurospora crassa[9]等在雙組分組氨酸激酶 (two component histidine kinase，TCHK) 上的突變研究表明，TCHK 是二甲酰亞胺類殺菌劑的主要作用靶點。嚴蕾燕等[10]通過敲除灰葡萄孢TCHK 傳遞系統途徑上5 個關鍵基因 BcOS1、BcOS2、BcOS4、BcOS5 和BRRG-1，并測定基因敲除突變體的藥劑敏感性發現，只有BcOS1 基因敲除突變體對DCFs 表現抗性，其他4 個基因敲除突變體對該類藥劑表現更為敏感。因此，嚴蕾燕等認為BcOS1 是DCFs的靶標位點，該基因上的點突變可能會導致病原菌對DCFs 產生抗性。目前報道的灰葡萄孢抗藥性菌株BcOS1 基因上有I365N/R/S、V368F、Q369P/H、N373S 和T447S 等突變類型，其中除了Q369P 突變會導致灰葡萄孢對DCFs 產生低、中或高水平抗性外，其余突變類型均會導致灰葡萄孢對DCFs 產生低水平抗性[11]。

根據菌絲生長速率法或孢子萌發法測定病原菌對藥劑的敏感性，是判定灰葡萄孢是否為抗藥性菌株的傳統方法[12]。雖然傳統檢測方法得出的結果可靠，但是檢測周期長，步驟繁瑣。環介導等溫擴增技術 (loop-mediated isothermal amplification，LAMP) 是一種操作簡單、精確度高、反應速度快且特異性高的檢測方法[13-14]，可以用于檢測特定的病原菌種類。由于作用靶標發生點突變是目前植物病原菌產生抗藥性的主要機制，因此，近年來已有學者根據病原菌抗藥性分子機制，利用堿基錯配原則檢測DNA 片段上單堿基的差異，將LAMP 技術用于檢測由點突變引起的病原菌對藥劑的抗性[15-17]。

本研究測定了從浙江省5 個地區采集的200株灰葡萄孢對腐霉利的抗性，分析了抗性分子機制，在此基礎上建立了可以特異性檢測灰葡萄孢對腐霉利高抗基因型的LAMP 檢測技術，以期為腐霉利的進一步使用及灰葡萄孢的抗藥性治理提供理論依據和技術手段。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2017—2018 年從浙江省5 個地區 (寧波市、臺州市、湖州市、杭州市和嘉興市) 的草莓種植基地采集灰霉病樣品，參考杜穎等[11]的方法進行單孢分離純化，共獲得200 株灰葡萄孢，其中寧波50 株，臺州37 株，湖州37 株，杭州32 株，嘉興44 株。將獲得的單孢菌株編號 (地點縮寫 +B + 序號)，保存至斜面凍存管中，于 ?4 ℃保存備用。

1.2 供試藥劑、試劑與培養基

供試藥劑：95%腐霉利 (procymidone) 原藥由浙江新安化工集團股份有限公司提供。

LAMP 體系試劑：(8 U/μL) Bst DNA Polymerase購自諾唯贊生物科技有限公司；10 × Thermopol Buffer、10 mmol/L dNTP Mix 購自 TaKaRa 生物工程公司、甜菜堿 (Betaine) 和羥基萘酚藍 (HNB) 購自Sigma 公司；25 mmol/L MgCl2購自生工生物工程股份有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基 (PDA)：稱取去皮土豆200 g，煮沸后過濾，加入20 g 葡萄糖和20 g瓊脂，加無菌水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌30 min，備用。

1.3 灰葡萄孢對腐霉利的抗性檢測

參考趙虎等[5]的區分劑量法，分別利用5、20 和100 μg/mL 作為灰葡萄孢對腐霉利敏感性水平的區分濃度。在5 μg/mL 上不能生長的灰葡萄孢是敏感菌株；在5 μg/mL 上能生長、20 μg/mL上不能生長的為低抗菌株；在20 μg/mL 上能生長、100 μg/mL 上不能生長的為中抗菌株；在100 μg/mL 上能生長的為高抗菌株。分別將200 個菌株活化到PDA 平板上，取菌落邊緣的菌餅 (直徑為5 mm) 轉移至新鮮的PDA 平板上，培養3 d 后打取直徑5 mm 的菌餅接種到含不同質量濃度腐霉利的PDA 培養基平板上。每個處理重復3 次。置于23 ℃下黑暗培養3 d 后，統計在含不同質量濃度腐霉利PDA 板上生長的菌株數量，按公式(1) 分別計算灰葡萄孢對腐霉利表現低水平、中水平和高水平抗性菌株的頻率。

式中：X—抗藥性頻率，%；N1—抗藥性菌株數；N2—供試總菌株數。

1.4 腐霉利抗感菌株的BcOS1 基因的分析

根據灰葡萄孢組氨酸激酶基因BcOS1 序列(基因登錄號：AF396827.2)，參考杜穎等[11]的文獻合成4 對引物，記為S1～S4 (表1) 用于擴增BcOS1 基因全長。采用25 μL 反應體系，包含以下組分：12.5 μL 2 × Tag 聚合酶，上、下游引物各 1 μL，DNA 模板 1 μL。PCR 擴增參數為：94 ℃5 min；94 ℃ 30 s；55～62 ℃ 30 s；72 ℃ 2 min，34 個循環；72 ℃ 10 min。PCR 擴增產物的測序結果由SeqMan 11.2 和EditSeq 7.1 生物軟件進行分析。

1.5 LAMP 引物的設計

以灰葡萄孢對腐霉利抗性菌株BLB-13 的BcOS1 基因 (基因登錄號：MT375849) 含有Q369P 點突變的序列為模板，使用在線軟件Primer Explore (http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html) 設計檢測引物，記為S5 (表1)。引物干粉用ddH2O 溶解后置于 ?4 ℃冰箱中保存，備用。

1.6 LAMP 擴增反應體系的優化

參考胡小然等[18]LAMP 擴增反應體系，分別對擴增體系中的各反應組分濃度進行優化：Bst DNA 聚合酶濃度依次設為0.08、0.16、0.24 和0.32 U/μL；Mg2+濃度依次設為 2.0、3.0、4.0、5.0 和 6.0 mmol/L；dNTP 濃度依次設為 0.4、0.6、0.8、1.0 和 1.2 mmol/L；FIP 和 BIP 的濃度分別依次設為 0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 和 2.0 μmol/L；F3 和B3 的濃度分別依次設為0.2、0.3、0.4、0.5 和0.6 μmol/L；甜菜堿濃度依次設為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和 1.2 mmol/L。每個處理 3 個重復，試驗重復3 次，下同。

1.7 LAMP 擴增反應條件的優化

參考胡小然等[18]LAMP 擴增反應條件進行優化。將反應最優體系溶液分別在59、60、61、62、63、64、65 和66 ℃恒溫條件下反應60 min，然后在最佳反應溫度下分別反應10、20、30、40、50、60、70 和80 min。擴增反應結束后，觀察反應管顏色變化，以確定最佳反應時間和反應溫度。

1.8 LAMP 擴增反應的靈敏度

利用真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒 (上海生物工程有限公司) 提取菌株BLB-13 (高抗) 菌絲DNA，測定其質量濃度后進行10 倍梯度稀釋, 用作LAMP 擴增反應靈敏度測試的模板。質量濃度梯度分別設置為 10 × 100、10 × 10?1、10 × 10?2、10 × 10?3、10 × 10?4、10 × 10?5、10 × 10?6和 10 ×10?7ng/μL。為了比較 LAMP 和常規 PCR 之間的靈敏度，使用引物F1 和R1 (表1)，擴增BcOS1基因上包含第369 位約1719bp 的DNA 片段，PCR 反應程序如1.4 節所述。

1.9 LAMP 擴增反應的特異性

為了評估LAMP 的特異性和準確性，分別以敏感、I365S/N 和Q369P + N373S 突變類型的菌株的DNA 作為模板，每種突變類型各選2 株菌株。在最佳反應條件下，通過觀察反應管顏色變化判斷LAMP 擴增的特異性。

2 結果與分析

2.1 灰葡萄孢對腐霉利的抗性

從浙江省5 個地區采集分離的200 株灰葡萄孢對腐霉利的總抗性頻率高達71.5%，其中低水平抗性菌株 (LR) 100 株，頻率為50%；中水平抗性菌株 (MR) 38 株，頻率為19%；高水平抗性菌株 (HR) 5 株，頻率為2.5% (圖1)。

2.2 腐霉利抗感菌株的BcOS1 序列比對分析

通過比對32 個抗性菌株的堿基序列發現在BcOS1 基因上存在3 種突變類型 (表2)。低抗菌株和中抗菌株的第365 位密碼子由ATC 突變成AGC或AAC，導致氨基酸由異亮氨酸 (Ile，I) 突變成絲氨酸 (Ser，S) 或天冬酰胺 (Asn，N)；高抗菌株的第369 和373 位密碼子同時發生突變，導致第369 位氨基酸由谷氨酰胺 (Gln，Q) 突變成脯氨酸(Pro，P)，第373 位氨基酸由天冬酰胺 (Asn，N)突變成絲氨酸 (Ser，S)。

表2 灰葡萄孢BcOS1 堿基序列及氨基酸的比較Table 2 Comparison of base sequence and amino acids of different strains of BcOS1

2.3 LAMP 檢測體系的優化

最終確定LAMP 檢測體系的最佳濃度組分(表 3)：Bst DNA 聚合酶為 0.16 U/μL，Mg2+為3 mmol/L，dNTP 為1 mmol/L，內引物FIP 和BIP均為 1.2 μmol/L，外引物 F3 和 B3 均為 0.4 μmol/L，甜菜堿為0.6 mmol/L。

表3 LAMP 體系Table 3 LAMP component

2.4 LAMP 檢測體系的反應條件

結果表明：當溫度在59～61 ℃時，反應管顏色不變；當溫度到達62 ℃時，反應管顏色開始變藍；當溫度到達63 ℃時，反應管顏色明顯變藍，因此確定63 ℃為最佳反應溫度 (圖2)。在63 ℃下，當反應進行50 min 時，反應管變化最明顯(圖3)。因此，確定該體系的最佳反應條件為反應溫度63 ℃、時間50 min。

2.5 LAMP 檢測的靈敏度

以BLB-13 菌株的DNA 為模板，10 倍梯度稀釋DNA。結果表明：當DNA 質量濃度為10 ×10?4ng/μL 時，LAMP 反應管顏色仍為紫色，表明此時LAMP 反應已檢測不到DNA，說明該檢測體系的最低檢測限為 10 × 10?3ng/μL。而常規PCR 的最低檢測限僅為 10 × 10?2ng/μL，可見，LAMP 檢測比常規 PCR 的靈敏度高 10 倍 (圖 4)。

2.6 LAMP 檢測特異性

結果(圖5)表明，敏感菌株、低水平和中水平抗藥性菌株中的Ⅰ類突變和Ⅱ類突變的反應管均呈陰性反應，顏色無明顯變化，只有高水平抗藥性菌株，即第 Ⅲ 類突變的反應管由紫色變為天藍色，表明該LAMP 檢測具有較好的特異性。

3 結論與討論

灰霉病是影響草莓產量和質量的主要病害。二甲酰亞胺類殺菌劑 (DCFs) 腐霉利作為草莓灰霉病防治的主要藥劑之一，有報道指出，草莓灰葡萄孢已對其產生嚴重的抗性[16]，然而浙江省內卻缺乏相關研究報道。本研究通過區分劑量法測定了浙江省5 個地區共200 株草莓灰葡萄孢對腐霉利的抗性水平，總抗性頻率為71.5%。與遼寧、山西省等地相比，抗性頻率相對較低[11,19]，這可能與不同地區施藥水平不同有關。同時本研究發現，浙江省灰葡萄孢對腐霉利的抗性菌株以低水平抗性為主，占抗性菌株的69.9%。因此本研究認為，腐霉利可繼續用于浙江省草莓灰霉病的防治，但前提是要加強灰葡萄孢對腐霉利的抗性監測。

Lerous 等[20]通過對雙組分組氨酸激酶(TCHK) 的基因測序比對發現，田間灰葡萄孢抗性菌株的BcOS1 第365 位氨基酸由異亮氨酸突變為絲氨酸，認為該點突變可能影響了病原菌對二甲酰亞胺類殺菌劑的敏感性。Oshima 等[9]也在灰葡萄孢對該類藥劑的抗性菌株上發現同樣的突變類型，認為該基因序列的突變導致了菌株對藥劑產生了抗性。本研究通過比對敏感、抗性菌株BcOS1基因序列表明，草莓灰葡萄孢抗腐霉利菌株有3 種突變類型：第Ⅰ類和第Ⅱ類分別為第365 位氨基酸由異亮氨酸 (I) 突變成絲氨酸 (S) 或天冬酰胺(N)，即I365S/N；第 Ⅲ 類包含兩個突變位點，分別為第369 位氨基酸由谷氨酰胺 (Q) 突變成脯氨酸(P) 和第373 位氨基酸由天冬酰胺 (N) 突變成絲氨酸 (S)，即Q369P + N373S。過去已有研究者報道，這3 種突變類型可能是灰葡萄孢對二甲酰亞胺類殺菌劑產生抗性的原因[21-23]。此外，本研究發現，I365S/N 突變類型菌株的抗性水平為低抗或中抗，而Q369P + N373S 突變類型菌株的抗性水平為高抗。Muhammad 等[21]也報道了 Q369P + N373S 突變會導致灰葡萄孢對腐霉利產生高水平抗性。而杜穎等[11]研究中顯示，BcOS1 基因編碼的氨基酸上發生Q369P 突變后，菌株不僅表現為低抗，還可能表現中高或高抗。因此N373S 突變在灰霉病菌對腐霉利產生高水平抗性中的貢獻還需進一步研究。

在抗藥性分子機制分析的基礎上，本研究建立了可以快速檢測灰葡萄孢對腐霉利高抗菌株Q369P 的技術。傳統的抗藥性檢測主要是通過組織或單孢分離的方法分離培養病原菌，再根據菌絲生長速率法或孢子萌發法來判定是否為抗性菌株[12]，該方法檢測周期長，步驟繁瑣。后來研究者根據抗藥性的分子機制設計錯配引物擴增病原菌的DNA，通過PCR 技術可特異性區分敏感和抗藥性菌株[24]，但也存在耗時長、檢測成本高等不足，且不適用于田間的快速檢測。本研究建立的快速檢測體系可在63 ℃恒溫條件下，用時50 min 便可完成整個檢測，并且具有較高的靈敏度，該體系理論上能檢測到低至質量濃度為10 ×10?3ng/μL 水平的基因組 DNA，是普通 PCR 反應的10 倍。Zou 等[25]報道過一種可在30s 內快速提取病原真菌DNA 的方法，在未來可將該方法與LAMP 檢測技術相結合，從而實現在田間對灰葡萄孢更為快速、簡單的檢測。