不同類型Monilinia fructicola 菌株的溫度適應性及其對苯并咪唑類殺菌劑和乙霉威的交互抗性

陳鳳平, 鄭鈺瓏, 周 挺, 張 玥, 黃中喬, 劉西莉*,,4

(1. 福建農林大學 閩臺作物有害生物生態防控國家重點實驗室，福州 350002；2. 中國煙草總公司福建省公司，福州 350003；3. 中國農業大學 植物病理學系，北京 100193；4. 西北農林科技大學 植物病理學系，陜西 楊凌 712100)

0 引言

褐腐病菌Monilinia fructicola (G. Winter)Honey 是引起果樹褐腐病的重要病原菌[1-2]，對果樹的花、莖、果實等均可為害，尤其以為害成熟期及儲藏期的果實為重。該病原菌可以侵染多種果樹，主要包括桃、李、櫻桃等核果類果樹，以及梨、蘋果等仁果類果樹。病菌侵染果實后，首先在果實上出現淡褐色斑點，隨后迅速擴展產生大量的分生孢子，分生孢子還會引起再侵染造成更大范圍的危害，被侵染的果實后期會縮水干燥形成僵果[3]。M. fructicola 主要分布在美洲，是歐洲的檢疫性病原，近年來，該病原菌在中國多個桃產區，包括北京、山東、中部、西部及東南地區等均有報道[2,4-6]。對于果樹褐腐病，生產中還是以化學防治為主，許多內吸性殺菌劑如苯并咪唑類殺菌劑 (methyl benzimidazole carbamates, MBCs)、甾醇脫甲基抑制劑 (sterol demethylation inhibitors,DMIs)、Qo 位點抑制劑 (quinone outside inhibitors,QoIs) 及琥珀酸脫氫酶抑制劑 (succinate dehydrogenase inhibitors, SDHIs) 均可有效控制褐腐病的發展[7-10]。

MBCs 類殺菌劑殺菌譜廣，具有很好的內吸性，對哺乳動物安全。自20 世紀被開發以來，一直被廣泛用于控制植物真菌病害的流行和危害，代表性藥劑如多菌靈、苯菌靈、甲基硫菌靈等。其作用機制是通過與病原菌微管蛋白結合而影響微管的正確組裝，從而破壞紡錘絲的形成，最終阻礙病原菌細胞的正常有絲分裂，起到殺菌作用[11-12]，因此該類殺菌劑也稱為β-微管蛋白抑制劑。該類藥劑對褐腐病有很好的防治效果，然而由于其作用位點單一，長期使用會產生抗藥性問題。截至目前，已有多篇文獻報道了M. fructicola對MBCs 的抗性，如Ma 等檢測到其對苯菌靈和甲基硫菌靈產生了抗性，且引起低抗和高抗的原因是菌株Tub2 基因上的氨基酸發生了變異，分別為H6Y 和E198A 點突變[13]；隨后，其他研究者也發現，Monilinia spp. 對苯并咪唑類殺菌劑的抗性相關突變位點為E198A，且該突變位點廣泛存在，如在美國加利福尼亞州[14]和南卡羅來納州[15]，以及巴西[16]、意大利、法國、西班牙和瑞士[17]均有報道。

乙霉威屬于氨基甲酸酯類殺菌劑，其對MBCs表現敏感的菌株具有天然不敏感性，但其與多菌靈、甲基硫菌靈等常用的MBCs 具有負交互抗性，因此，生產中乙霉威常作為治理對MBCs 產生抗性菌株的重要殺菌劑。例如：沈宙等研究發現，當多菌靈與乙霉威按質量比1 : 1 混配時，其對多菌靈抗性的番茄灰霉病菌的聯合作用系數(共毒系數)達到 460.63[18]；Zhu 等發現，200 μg/mL的多菌靈和乙霉威混劑 (質量比4 : 1)，對抗多菌靈菌株Sclerotinia sclerotiorum 的保護效果達100%，治療效果為87.1%[19]；Malandrakis 等檢測了來自希臘與M. fructicola 同屬的M. laxa 菌株對多菌靈的敏感性，發現有37% 的菌株為高抗菌株，多菌靈對該菌株的EC50值大于500 μg/mL，但該菌株對乙霉威卻表現敏感[20]。在M. fructicola中也發現多菌靈抗性菌株對乙霉威具有負交互抗性[21]。然而，也有研究者報道，在灰霉病菌中，部分菌株對乙霉威和多菌靈產生了雙重抗性[22]。

本研究組在前期研究中發現，對甲基硫菌靈產生抗性的M. fructicola 菌株，在其Tub2 蛋白序列上存在3 個與抗性有關的點突變，包括E198A、E198Q 及F200Y[7]。因此，本研究進一步檢測了含不同點突變的M. fructicola 菌株在不同溫度下的生長特性，及其對甲基硫菌靈、多菌靈和乙霉威的敏感性差異，明確不同類型菌株的溫度適應性及其對乙霉威的交互抗性情況，旨在為進一步監測褐腐病菌對MBCs 類殺菌劑的抗性發生發展提供理論基礎，為利用乙霉威治理MBCs 抗性菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑與培養基

殺菌劑：98.5% 甲基硫菌靈 (thiophanatemethyl) 原藥、98.0%多菌靈 (carbendazim) 原藥及99.1%乙霉威 (diethofencarb) 原藥，均由沈陽化工研究院合成。甲基硫菌靈與乙霉威用丙酮溶解，而多菌靈溶解于0.2 mol/L 的鹽酸中，均配制成1 × 104μg/mL 的母液，于 4 ℃ 冰箱中貯存，備用。

PDA 培養基：200 g 馬鈴薯，20 g 葡萄糖，20 g 瓊脂粉，用去離子水定容至1 L。于121 ℃，高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 供試菌株

4 種類型M. fructicola 菌株均源自中國農業大學種子病理藥理實驗室保存庫，分別為對甲基硫菌靈表現敏感的菌株3 株；對甲基硫菌靈表現為抗性且在β-微管蛋白上分別攜帶E198A、E198Q及F200Y 點突變的菌株各3 株 (表1)[7]。上述菌株分別用S、R(E198A)、R(E198Q)及R(F200Y)表示。

1.3 試驗方法

1.3.1 溫度對不同類型菌株生長的影響 選取在PDA 平板上培養5 d 的新鮮菌落，在菌落邊緣同一圓周上打取5 mm 菌餅，接種于PDA 平板上，每皿接種1 個菌餅，每菌株3 次重復。分別置于13、18、25、28 及33 ℃培養箱中，黑暗培養5 d，測量各溫度培養箱下各菌株的菌落直徑，并利用公式 (1)[23]分析菌落直徑與溫度的關系，計算不同類型菌株的最適生長溫度。同時根據公式 (2) 計算各菌株的生長速率，并求出每類菌株的平均生長速率。

式 (1) 中：DT為菌落直徑，T 為溫度，a、b 和 c 為常數。

式 (2) 中：Gr為生長速率，DT和t 分別表示T 溫度培養下的菌落直徑和培養時間。

1.3.2 甲基硫菌靈對不同類型菌株生長的影響配制甲基硫菌靈的系列質量濃度藥液，將其分別加入冷卻至約45 ℃的PDA 培養基中，制成終濃度分別為 0.1、1、5 及 50 μg/mL 的含藥平板，并以含等量丙酮的PDA 平板為對照。在預培養的各菌株菌落邊緣打取直徑5 mm 的菌餅，接種于以上平板中央，置于23 ℃培養箱中黑暗培養，每處理3 次重復。當對照菌落直徑達到培養皿直徑的80%左右時，采用十字交叉法測量菌落直徑，按照公式 (3)[24-25]求出菌株在各甲基硫菌靈濃度處理下的相對生長量 (%)。

表1 不同點突變菌株對苯并咪唑類殺菌劑和乙霉威的交互抗性Table 1 Cross resistance between methyl-benzimidazole carbamates and diethofencarb in Monilinia fructicola isolates with different mutations in β-tubulin gene

式 (3) 中：RGi為i 處理的相對生長量，Di和D0分別表示i 處理和對照的平均菌落直徑。

2．5 慢性病相關知識來源情況 被調查小學生最信任和最喜歡的健康知識來源分別是老師講課和電視，飲食和運動習慣受家人影響的比例最高。見表5。

1.3.3 多菌靈對不同類型菌株生長的影響 配制多菌靈系列質量濃度藥液，將其分別加入冷卻至約45 ℃的PDA 培養基中，制成終濃度分別為0.01、0.1、1、5 及 50 μg/mL 的含藥平板。以不含藥PDA 平板為空白對照，并接菌于平板上，每處理3 次重復。于23 ℃黑暗培養5 d 后，由公式 (3)求出菌株在各多菌靈濃度處理下的相對生長量 (%)。

1.3.4 乙霉威對不同類型菌株生長的影響 配制乙霉威系列質量濃度藥液，將其分別加入冷卻至約45 ℃的PDA 培養基中，制成終濃度分別為0.1、1、5 及 50 μg/mL 的含藥平板，以不含藥PDA 平板為對照，并接菌于平板上，每處理3 次重復。于23 ℃黑暗培養5 d 后，由公式 (3) 求出菌株在各乙霉威濃度處理下的相對生長量 (%)。

1.3.5 交互抗藥性測定及分析 根據1.3.2～1.3.4 節的試驗結果，分別選擇甲基硫菌靈、多菌靈和乙霉威的區分濃度。分別配制終濃度為1 μg/mL 的甲基硫菌靈、多菌靈和乙霉威含藥PDA 平板，同時設置兩種對照處理，甲基硫菌靈和乙霉威處理的對照為含0.1%丙酮的PDA 平板處理，多菌靈處理的對照為不含丙酮的PDA 平板處理，每處理重復3 次。選取5 mm 菌餅接菌于各平板中央，23 ℃黑暗培養5 d，以十字交叉法測定各菌株的菌落直徑，并計算菌株在每個處理下的平均菌落直徑，用公式 (3) 計算菌株的相對生長量。以對乙霉威的相對生長量為縱坐標，對甲基硫菌靈或多菌靈的相對生長量為橫坐標，用公式 (4)[26]分別分析 S 型菌株與R(E198A)、R(E198Q)和R(F200Y)型菌株對兩種藥劑的相對生長量的相關性，計算相關系數r 值及p 值，并根據r 值、p 值和表型判斷交互抗性情況。當 p 值 ＜ 0.05、r 值 ＜ 0，且對甲基硫菌靈或多菌靈抗性的菌株對乙霉威表現敏感時，則判定該類型菌株對乙霉威存在負交互抗性；當p 值 ＞ 0.05，無論r 值大小和表型如何，則判定該類型菌株對兩種藥劑均不存在交互抗性。

式 (4) 中：y 為對乙霉威的相對生長量，x 為對甲基硫菌靈或多菌靈的相對生長量，a 和b 為常數。

2 結果與分析

2.1 不同類型菌株對溫度適應性

分別于13、18、25、28 及33 ℃下培養4 種類型菌株。結果表明，所有菌株均可以在13～28 ℃之間生長，但均不能在33 ℃下生長；所有菌株均表現為在一定溫度范圍內隨溫度的升高，菌落生長加快，但當溫度達到一定高度后，又隨溫度的升高，菌落生長減慢。進一步分析菌落生長與培養溫度的關系發現，4 種類型菌株對溫度的生長曲線模式相同，均呈現為顯著的二階多項式相關 (圖 1A～1D，p 值均 ＜ 0.05)；但最適生長溫度具有一定的差異，敏感菌株與R(E198A)型抗性菌株的最適生長溫度相同且最高，均為22.7 ℃(圖1A～1B)，R(F200Y)型抗性菌株的最適生長溫度次之，為22.1 ℃(圖1C)，而R(E198Q)型菌株的最適生長溫度最小，為22.0 ℃(圖1D)。

2.2 不同類型菌株的生長速率差異

分析4 種類型菌株分別在13、18、25 及28 ℃下生長速率的差異。結果 (圖2A～2D)表明，其生長速率范圍分別為 0.11～0.23 cm/d、0.25～0.36 cm/d、0.46～0.69 cm/d 及 0.03～0.60 cm/d；其中，S、R(E198A)及R(F200Y)型菌株在所有溫度條件下的生長速率均無顯著差異，而R(E198Q)型菌株生長速率均表現為最慢，且在13 ℃和28 ℃條件下顯著低于其他3 類菌株。

2.3 甲基硫菌靈對不同類型菌株生長的影響

2.4 多菌靈對不同類型菌株生長的影響

當多菌靈的處理質量濃度為0.01 μg/mL 時，所有菌株的相對生長量均大于95%。當其質量濃度為0.1 μg/mL 時，S 型菌株的平均相對生長量僅為8.5%，其他3 類抗性菌株的相對生長量均大于98.0%，3 類抗性菌株的相對生長量顯著高于S 型菌株，但抗性菌株間無顯著差異 (圖4A)。當處理質量濃度提高到1.0 μg/mL 時，S 型菌株的平均相對生長量僅為3.0%，R(E198A)和R(F200Y)型抗性菌株相對生長量仍大于100.0%，但 R(E198Q)型菌株的相對生長量降低到45.8%，且顯著低于其他兩類抗性菌株 (圖4B)。當處理質量濃度提高到5.0 μg/mL時，S 型菌株和R(E198Q)型菌株停止生長，R(E198A)和R(F200Y)型抗性菌株相對生長量仍大于80.0%，但R(F200Y)型菌株顯著低于R(E198A)型菌株 (圖4C)。隨著處理濃度進一步提高到50.0 μg/mL 時，除了R(E198A)型菌株，其他3 類菌株均停止生長 (圖4D)。綜合表明，S 型菌株對多菌靈表現敏感；R(E198A)、R(E198Q)和 R(F200Y)3 種類型菌株均對多菌靈表現抗性，但抗性有所差異，其中R(E198Q)型抗性水平相對較低，R(F200Y)型次之，R(E198A)型抗性水平最高。

2.5 乙霉威對不同類型菌株生長的影響

當乙霉威的處理質量濃度為0.1 μg/mL 時，S 型菌株的平均相對生長量最高，為98.8%，其他3 類抗性菌株的相對生長量范圍為59.9%～94.8%，3 類抗性菌株中R(E198Q)型的相對生長量顯著低于其他兩類 (圖5A)。當處理質量濃度提高到1.0 μg/mL 時，R(E198A)型抗性菌株的平均相對生長量僅為0.2%；S 型、R(E198Q)和R(F200Y)型菌株相對生長量范圍為87.3%～96.2%，且三者之間無顯著差異 (圖5B)。當處理質量濃度提高到5.0 μg/mL時，R(E198A)型菌株停止生長；S 型、R(E198Q)和R(F200Y)型菌株相對生長量范圍為92.7%～101.7%，且三者之間無顯著差異 (圖5C)。隨著處理濃度進一步提高到50.0 μg/mL 時，除了R(E198A)型菌株，其他3 類菌株依然可以生長，且R(F200Y)型和S 型無顯著差異，但顯著高于R(E198Q)型 (圖5D)。綜合表明，R(E198A)型菌株對乙霉威表現敏感，S 型菌株表現為天然不敏感，R(E198Q)和 R(F200Y)兩種類型則表現為抗藥性，且抗性水平差別不大。

2.6 MBCs 與乙霉威的交互抗性

綜合2.3～2.5 節的分析結果可見，當甲基硫菌靈和多菌靈的處理質量濃度達1.0 μg/mL 時，可以明顯區分S 型和其他3 類菌株。因此，選擇質量濃度為1.0 μg/mL 時的相對生長量分析其與乙霉威的交互抗性情況。如表1 所示，3 株S 型菌株對甲基硫菌靈的相對生長量均小于2.0%，但對乙霉威的相對生長量均大于80.0%，表明這3 個菌株對乙霉威均表現為天然不敏感性；3 株R(E198A)型菌株對甲基硫菌靈的相對生長量均大于94.0%，但其對乙霉威的相對生長量均小于1.0%，表明這3 株菌株對乙霉威均表現敏感；而R(E198Q)型和R(F200Y)型菌株，對甲基硫菌靈和乙霉威的相對生長量均大于84.0%，表明這些菌株對乙霉威表現抗性 (表1)。相關性分析結果表明，S 和R(E198A)型組合菌株對甲基硫菌靈的敏感性與乙霉威存在顯著負相關性 (圖 6A，r =?0.992，p = 0.000)；S 分別和R(E198Q)型和R(F200Y)型組合菌株對甲基硫菌靈的敏感性與乙霉威具有一定的正相關性，但相關性不顯著 (圖 6B～6C，p 均 ＞ 0.050)。分析多菌靈與乙霉威的交互抗藥性，發現不同類型組合菌株的表現結果與甲基硫菌靈一致 (表1，圖6D～6F)。

綜合以上研究結果，說明β-微管蛋白上不同點突變的菌株對MBCs 和乙霉威的交互抗藥性結果不同，只有198 位從谷氨酸變成丙氨酸 (E198A)時，MBCs 與乙霉威之間才存在負交互抗性；而其他兩種突變如當198 位從谷氨酸變成谷氨酰胺(E198Q) 或200 位從苯丙氨酸變成酪氨酸 (F200Y)時，MBCs 與乙霉威均不存在負交互抗性。

3 結論與討論

本課題組前期研究發現，M. fructicola 菌株對甲基硫菌靈的抗性與Tub2 蛋白上的3 種點突變有關，即E198A、E198Q 和F200Y，且每一株抗性菌株在Tub2 蛋白上只含有其中一種突變位點[7]。已有研究表明，該3 種突變菌株在22 ℃環境中，其生長速率與敏感菌株均無差異[7]。而本研究結果表明，3 種突變菌株的生長速率與溫度有一定關系，其中R(E198A)和R(F200Y)型菌株在4 種溫度下的生長速率與敏感菌株之間均無差異；但R(E198Q)型菌株在不同溫度下表現不同，在低溫 (13 ℃) 和高溫 (28 ℃) 時，其生長速率顯著低于其他3 類菌株，推測R(E198Q)型菌株在逆境中的競爭力弱于其他抗性菌株及敏感菌株，該特性可能是R(E198Q)型菌株在田間很少被發現和報道的原因之一。

甲基硫菌靈和多菌靈是MBCs 的典型代表藥劑，其對病原菌的抑制活性存在一定差異，然而在生產實踐中，通常使用共同的區分濃度即50 μg/mL 作為 M. fructicola 抗性檢測的區分濃度[15,17]。本研究發現，在M. fructicola 中，抗MBCs的不同類型菌株對甲基硫菌靈和多菌靈的敏感性也存在一定差異。例如，在5 μg/mL 甲基硫菌靈處理中，R(E198Q)型菌株可以生長，但同樣濃度的多菌靈處理則可以完全抑制R(E198Q)型菌株的生長。研究者經常采用較高的區分濃度進行病原菌的抗藥性檢測，這可能導致R(E198Q)型菌株很少被報道。因此，為避免某些抗性菌株在研究中被漏檢，測定不同MBCs 時最好采用不同的區分濃度。針對M. fructicola 菌株對多菌靈的抗性檢測，其區分濃度建議降低為1 μg/mL，而對甲基硫菌靈進行抗性檢測的區分濃度可以是1 μg/mL 或5 μg/mL。

乙霉威通常被作為MBCs 類藥劑的抗性治理藥劑，然而本研究發現，不同Tub2 突變位點引起的抗MBCs 菌株對乙霉威的敏感性不同。乙霉威和MBCs 的負交互抗性與M. fructicola 的Tub2 基因變異情況有關，只有Tub2 蛋白在198 位發生突變并且由谷氨酸突變為丙氨酸 (E198A) 時，該抗性菌株對乙霉威才表現為敏感；其他由E198Q 或F200Y 突變引起的抗MBCs 菌株，對乙霉威依然保持抗性狀態；說明乙霉威和MBCs的負交互抗性并不是存在于所有的抗MBCs 菌株中，因此，在生產中利用乙霉威治理M. fructicola對MBCs 的抗性時，首先需鑒定從相關區域分離獲得的抗性菌株的突變類型。Chen 等在研究M. fructicola 對多菌靈和乙霉威的敏感性時發現，所有抗多菌靈菌株對乙霉威均表現敏感，進一步分析發現，抗性菌株的Tub2 蛋白均攜帶E198A 突變[21]。該研究結果也可以為其他研究提供借鑒，例如在灰霉病菌抗藥性相關研究中，劉圣明等發現大量菌株對多菌靈和乙霉威均表現抗性，抗性頻率分別達到81.29%和93.53%，這可能與大部分抗多菌靈菌株未發生E198A 突變有關[22]。

綜上所述，在M. fructicola 對MBCs 產生抗性的3 類菌株中，R(E198Q)型菌株在溫度逆境中的生長速率低于其他兩類抗性菌株及敏感菌株；不同類型抗性菌株對不同MBCs 藥劑的敏感性有所差異，因此，使用區分濃度檢測抗性菌株時對于不同藥劑需有所不同；不同類型抗性菌株對乙霉威的交互抗性不同，乙霉威與多菌靈的負交互抗性現象僅存在于R(E198A)型菌株中。本研究結果可為未來監測M. fructicola 對MBCs 類藥劑的抗性發生發展情況以及制定有效的抗性治理策略提供理論支持，為有效控制褐腐病的流行和危害提供理論參考。