miR-4715-5p通過靶向MUC1基因對乳腺癌細胞遷移和增殖的影響

黃建棋 郭文利 范偉民 陸建菊 陸 凱

乳腺癌起源于乳腺上皮組織，是女性發生率最高的惡性腫瘤之一[1]。乳腺癌的發生率逐年上升且日趨年輕化[2]。盡管乳腺癌的治療手段得到很大發展，過度增殖和轉移仍是影響患者預后的主要因素[3]。因此，探究乳腺癌的增殖和轉移機制對尋找新的分子治療靶點具有重要臨床意義。微小RNA(miRNA)是一類內源性、非編碼、單鏈小分子RNA，負責調控人類基因組內30%基因的表達，對細胞遷移、侵襲、增殖、分化、凋亡等生物學過程至關重要[4, 5]。miRNA直接參與人類腫瘤如淋巴癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、乳腺癌等的發生和發展，與腫瘤的直徑、臨床分期、化療敏感度、放療敏感度等密切相關，miRNA可能成為腫瘤的生物學標志物和分子治療靶點[6,7]。miR-4715-5p是一個新近報道的miRNA，可有效抑制肺癌的生長和轉移，發揮抑癌基因功能[8]。然而，miR-4715-5p在乳腺癌中的表達、功能和分子機制尚不明確。本研究旨在觀察miR-4715-5p在乳腺癌組織和細胞系中的表達水平，分析高表達miR-4715-5p對乳腺癌細胞遷移和增殖的影響，探討miR-4715-5p在乳腺癌細胞中的分子機制，為乳腺癌的分子靶向治療提供新的思路。

材料與方法

1.組織標本：43例乳腺癌組織和癌旁組織來自2017年8月～2019年12月于筆者醫院乳腺病科經手術切除治療的患者。患者平均年齡為51.59±7.46歲；高分化 22例、中分化 16例、低分化5例；TNM 分期Ⅰ期 26 例、Ⅱ期13例、Ⅲ期4例；腫瘤直徑≤3cm 18例，>3cm 25例。所有組織標本均經兩名以上病理學專家確診，組織置于液氮中冷凍保存。本研究由筆者醫院醫學倫理學委員會批準。

2.細胞系和主要試劑：正常乳腺細胞系(MCF-10A)和乳腺癌細胞系(HCC1937、MCF-7、MB-MDA-468、SKBR3)均購自中國典型培養物保藏中心。Lipofectamine 3000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司。胎牛血清(FBS)、DMEM培養基、RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司。對照模擬物NC、miR-4715-5p模擬物(5′-AAGUUGGCUGCA-GUUAAGGUGG-3′)、MUC1 mRNA野生型質粒和突變型質粒購自上海吉瑪生物工程公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。qRT-PCR試劑盒購自美國Applied Biosystems公司。CCK-8試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司。抗β-actin、MUC1、p-PI3K、p-AKT、p-PDK1、MDM2抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。

3.細胞培養和轉染：采用含10% FBS、青霉素和鏈霉素的DMEM培養基培養MCF-10A和MB-MDA-468細胞，采用含10% FBS、青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養基培養HCC1937、MCF-7、SKBR3細胞，在37℃、5%CO2條件下培養。收集對數生長期的MCF-7細胞接種于6孔板，分別將2μl Lipofectamine 3000與5nmol NC模擬物或miR-4715-5p以體積比1∶50均勻混合，冰上靜止15min，緩慢加入6孔板，搖晃均勻后繼續培養，分別命名為對照組和實驗組。轉染48h后進行后續實驗。

4.RNA提取、反轉錄和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)：采用Trizol法提取乳腺癌組織和細胞系總RNA，反轉錄為cDNA。配置qRT-PCR反應體系20μl，設定反應參數：95℃預變性5min；62℃ 35s，70℃ 35s，共35個循環。以U6為內參檢測miR-4715-5p的表達水平，以β-actin為內參檢測MUC1 mRNA的表達水平。引物由上海生工生物科技服務有限公司合成，β-actin上游引物：5′-GGCACCACACCTTCTACAAT-3′，下游引物：5′-GCCTGGATAGCAACGTACAT-3′。miR-4715-5p上游引物： 5′-AAGTTGGCTGCAGTTAAGGTGG-3′，下游引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGT-3′。U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。MUC1上游引物： 5′-TGCCGCCGAAAGAACTACG-3′，下游引物：5′-TGGGGTACTCGCTCATAGGAT-3′。

5.細胞劃痕實驗：收集對數生長期的兩組MCF-7細胞，采用無血清RPMI-1640培養基制成密度為5×105個/毫升的單細胞懸液，以2毫升/孔接種至6孔板，待細胞貼壁后，采用200μl無菌槍頭在6孔板底部劃痕，采用PBS溶液洗3次，加入無血清RPMI-1640培養基，倒置顯微鏡下觀察并拍照，記錄劃痕面積S1。繼續培養 24h，倒置顯微鏡下觀察并拍照，記錄劃痕面積S2。細胞遷移率(%)= (S1-S2)/S1×100%。

6.CCK-8法：收集對數生長期的兩組MCF-7細胞，以5×103個/孔接種于96孔培養板，每孔200μl，在培養箱中分別培養1、2、3、4、5天，每孔加入30μl CCK-8溶液，在培養箱中繼續培養4h。采用酶標儀記錄在450nm波長下各孔的吸光度(A)值，繪制兩組MCF-7細胞的生長曲線。

7.生物信息學軟件預測和雙熒光素酶報告基因實驗：采用miRNAMap、miRWalk、PicTar軟件預測miR-4715-5p可互補結合的靶基因。收集對數生長期的MCF-7細胞接種于6孔板，細胞實驗分組：共轉染野生型質粒+NC、共轉染野生型質粒+miR-4715-5p、共轉染突變型質粒+NC、共轉染突變型質粒+miR-4715-5p。24h后分別檢測每孔螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

8.Western blot法：收集對數生長期的兩組MCF-7細胞，在冰上提取細胞總蛋白。配制10%十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，上樣后電泳110min。采用硝酸纖維素膜進行轉膜，于5%脫脂牛奶中封閉。配制一抗，稀釋比例：β-actin(1∶2000)、MUC1(1∶1000)、p-PI3K(1∶2000)、p-AKT(1∶2000)、p-PDK1(1∶1000)、MDM2(1∶2000)，在4℃冰箱中孵育過夜。配制二抗，在室溫下孵育3h。滴加ECL顯影液，在凝膠成像系統下成像，以β-actin為內參。

結 果

1.miR-4715-5p在乳腺癌組織和乳腺癌細胞系中的表達水平：miR-4715-5p在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達分別為0.91±0.38和4.89±0.64，miR-4715-5p在乳腺癌組織中的表達水平顯著低于癌旁組織(P<0.01，圖1)。miR-4715-5p在正常乳腺細胞系(MCF-10A)和乳腺癌細胞系(HCC1937、MCF-7、MB-MDA-468、SKBR3)中的表達分別為1.01±0.08、0.76±0.06、0.13±0.03、0.50±0.05、0.38±0.08，miR-4715-5p在乳腺癌細胞系中的表達水平顯著低于正常乳腺細胞系(P均<0.05)，MCF-7細胞中miR-4715-5p的表達水平最低(P<0.01，圖2)。

圖1 乳腺癌組織和癌旁組織中 miR-4715-5p的表達水平

圖2 乳腺癌細胞系和正常乳腺細胞系中 miR-4715-5p的表達水平 與MCF-10A細胞系比較，*P<0.05，**P<0.01

2.各組MCF-7細胞miR-4715-5p的表達水平：對照組和實驗組MCF-7細胞中miR-4715-5p的表達分別為1.13±0.30和9.98±1.10，實驗組miR-4715-5p的表達水平顯著高于對照組(P<0.01)，表明miR-4715-5p模擬物在MCF-7細胞中成功高表達。

3.高表達miR-4715-5p抑制MCF-7細胞的遷移：細胞劃痕實驗顯示(圖3)，對照組和實驗組細胞遷移率分別為69.58%±6.73%和34.84%±3.84%，實驗組細胞遷移率顯著少于對照組(P<0.01)，表明高表達miR-4715-5p可抑制MCF-7細胞的遷移。

圖3 高表達miR-4715-5p對MCF-7細胞遷移的影響 結晶紫染色,×100

4.高表達miR-4715-5p抑制MCF-7細胞的增殖：CCK-8法顯示(圖4)，接種MCF-7細胞第2天開始，與對照組比較，實驗組細胞的增殖能力顯著降低(P<0.05)，表明高表達miR-4715-5p可抑制MCF-7細胞的增殖。

圖4 高表達miR-4715-5p對MCF-7細胞增殖的影響 與實驗組比較，*P<0.05，**P<0.01

5.生物信息學軟件預測miR-4715-5p的靶基因：采用miRNAMap、miRWalk、PicTar軟件預測，miR-4715-5p互補結合的靶基因可能是MUC1，MUC1 mRNA突變序列見圖5。

圖5 miR-4715-5p與MUC1 mRNA互補結合的序列

6.雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-4715-5p互補結合MUC1 mRNA：雙熒光素酶報告基因實驗顯示，野生型質粒+NC組和野生型質粒+miR-4715-5p組的相對熒光素酶活性分別為1.02±0.11和0.33±0.06，野生型質粒+miR-4715-5p組相對熒光素酶活性被抑制(P<0.01)，而突變型質粒+NC組和突變型質粒+miR-4715-5p組相對熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)，表明miR-4715-5p可互補結合MUC1 mRNA，詳見圖6。

圖6 雙熒光素酶報告基因實驗驗證 miR-4715-5p的靶基因

7.高表達miR-4715-5p對MUC1 mRNA表達的影響：qRT-PCR實驗顯示，對照組和實驗組MCF-7細胞中MUC1 mRNA表達分別為1.06±0.21和0.22±0.07，表明高表達miR-4715-5p可抑制MUC1 mRNA的表達(P<0.01)。

8.高表達miR-4715-5p對MUC1蛋白及PI3K/AKT信號通路蛋白表達的影響：Western blot法實驗顯示，高表達miR-4715-5p后，MCF-7細胞中MUC1蛋白表達降低，PI3K/AKT信號通路蛋白p-PI3K、p-AKT、p-PDK1、MDM2表達降低(圖7)。

圖7 高表達miR-4715-5p對MCF-7細胞MUC1 蛋白及PI3K/AKT信號通路蛋白表達的影響

討 論

miRNA是一類由19～22個核苷酸組成的非編碼RNA，通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區不完全互補結合，誘導靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯，導致靶基因蛋白表達降低，從而參與細胞的各種生理和病理活動[9, 10]。越來越多的研究表明，miRNA可發揮癌基因或抑癌基因功能，通過調控靶基因表達，參與調控各種信號通路的活化，影響腫瘤的發生和進展[11, 12]。Cui等[13]研究發現，在人乳腺癌組織和MCF-7細胞中，miR-216a的表達水平均顯著降低，高表達miR-216a可抑制MCF-7細胞的遷移并促進其凋亡。Mansoori等[14]研究發現，與正常組織比較，miR-142-3p在乳腺癌組織中表達水平下調，高表達miR-142-3p可抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移，上調miR-142-3p可誘導多種抑癌miRNA包括miR-330，miR-145和miR-34a的表達。近年來的研究顯示，miR-4715-5p在肺癌組織和細胞系中表達水平顯著降低，高表達miR-4715-5p可顯著抑制肺癌細胞的增殖、遷移、侵襲和細胞周期，干擾miR-4715-5p表達可促進腫瘤的生長和轉移，miR-4715-5p發揮明顯的抑癌基因功能[8]。miR-4715-5p在乳腺癌細胞中的功能和分子作用機制尚不清楚。

本研究顯示，與癌旁組織比較，乳腺癌組織中miR-4715-5p的表達水平顯著降低；與正常乳腺細胞比較，乳腺癌細胞系中miR-4715-5p的表達水平顯著降低，提示miR-4715-5p可能參與乳腺癌發生、進展。采用體外轉染法高表達miR-4715-5p后，可顯著抑制乳腺癌MCF-7細胞的遷移和增殖，miR-4715-5p在乳腺癌中發揮明顯的抑癌基因功能。本研究采用miRNAMap、miRWalk、PicTar軟件預測，黏蛋白1(mucins 1，MUC1)可能是miR-4715-5p的靶基因。MUC1是一種高度糖基化的跨膜蛋白，主要表達于上皮細胞，介導多種信號轉導，與細胞的黏附和增殖密切相關[15, 16]。MUC1在結腸癌、胰腺癌、卵巢癌等腫瘤中明顯高表達，與腫瘤的惡性程度、淋巴結轉移、不良預后存在相關性[17, 18]。MUC1在乳腺癌組織中高表達，MUC1可誘導乳腺癌細胞對他莫昔芬的耐藥，MUC1表達較高的乳腺癌患者預后較差，沉默MUC1可抑制乳腺癌細胞的轉移和生長[19, 20]。本研究采用雙熒光素酶報告基因實驗證明，miR-4715-5p與MUC1可互補結合。本研究高表達miR-4715-5p后，MUC1基因表達顯著降低，進一步證明MUC1是miR-4715-5p的靶基因。PI3K/AKT信號通路是腫瘤細胞獲得異常轉移和增殖能力的關鍵機制[21]。Western blot法顯示，MUC1蛋白表達降低后，PI3K/AKT信號通路蛋白p-PI3K、p-AKT、p-PDK1、MDM2表達顯著降低，PI3K/AKT信號通路轉導被抑制，表明細胞的遷移和增殖能力降低。

綜上所述，本研究證實乳腺癌組織和細胞系中miR-4715-5p的表達水平顯著降低，高表達miR-4715-5p可通過干擾MUC1基因表達，阻滯PI3K/AKT信號通路轉導，抑制乳腺癌MCF-7細胞的遷移和增殖。本研究可能為乳腺癌發病機制研究和分子靶向治療提供新的方向。