外泌體活體示蹤的分子影像學研究進展

劉夢瑤 姜立新

外泌體是一種由各種細胞分泌的直徑為30～150nm的循環胞外囊泡，其生物發生機制較為復雜，通過“內吞-融合-胞吐”等一系列過程調節外泌體生成和組裝，最終被釋放至細胞外間隙或生物體液中。外泌體可攜帶多種膜蛋白、胞質蛋白、脂質、DNA和RNA等，參與細胞間通訊，具有多種生物學功能及廣泛的臨床應用[1]。然而由于外泌體的納米尺寸和高度特異性，如何有效地對外泌體進行活體示蹤，從而實時監測外泌體在體內外的生物學行為，是外泌體研究中十分重要的部分。

一、外泌體的生物發生

外泌體最早發現于1985年，由各種正常和腫瘤細胞從質膜釋放出的直徑為30～150nm的循環胞外囊泡，廣泛存在于血液、尿液、唾液和母乳等多種生物體液中[1,2]。外泌體的形成過程較為復雜，先由細胞外成分如蛋白質、脂類、代謝物、小分子等，通過內吞作用和質膜內陷，與細胞表面蛋白一起由外向內進入細胞形成早期分選核內體(early sorting endosomes，ESEs)，并與內質網、高爾基體和線粒體預先形成的ESEs融合。之后ESEs發展成熟為晚期分選核內體(late sorting endosomes，LSEs)，LSEs膜向腔內出芽形成包含諸多外泌體的多泡體(multivesicular bodies，MVBs)。MVBs除變成自噬小體及被溶酶體降解外，還可通過細胞骨架和微管網絡轉運至質膜，通過胞吐作用釋放腔內外泌體到細胞外環境中[3]。此時的外泌體表面表達細胞膜蛋白，內部包裹細胞質內容物，即使同一細胞來源的外泌體，其大小及內容物種類和含量也有所不同。外源性外泌體則通過凹陷、網格蛋白陷窩、脂閥、大胞飲、吞噬作用、受體介導的內吞作用、直接結合、直接融合等方式進入受體細胞[3]。這一復雜的重構過程導致外泌體攜帶多種膜蛋白(如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1即GPC1、四分子交聯體超蛋白家族 CD47、CD63等)、胞質蛋白、脂質、DNA、mRNA和miRNA，是人體內多功能的細胞間轉運系統，影響細胞生物學的各個方面。

二、外泌體的生物醫學應用

外泌體與免疫反應、病毒病理學、妊娠、心血管疾病、中樞神經系統疾病和癌癥進展密切相關[4，5]。由外泌體傳遞到受體細胞的蛋白質、代謝物和核酸改變細胞的生物反應，進而促進或抑制疾病。外泌體在調節細胞內信號通路方面的固有特性使其在許多疾病的治療方面具有潛在應用，包括神經退行性疾病和癌癥。外泌體具有良好的藥代動力學特性、生物相容性和較少的不良反應。因此可在生物體內運輸多種物質，包括小干擾RNA(siRNA)、反義寡核苷酸、化療藥物和免疫調節劑等，并將其遞送到靶細胞發揮治療效應。Kamerkar等[6]利用間充質細胞的外泌體制備了包載KrasG12D siRNA的工程化外泌體，通過CD47對胰腺癌細胞的特異性靶向作用精準遞送干擾Kras表達的siRNA，最終顯著抑制腫瘤生長和轉移，提高小鼠的總體生存率。

除此之外，外泌體也可用于疾病診斷，基于外泌體表面蛋白的液體活檢在癌癥和其他疾病的診斷和預后上具有潛在的應用價值。如GPC1富集在腫瘤外泌體中，可用來診斷胰腺癌、乳腺癌和結腸癌等，循環外泌體的數量變化也可反映腫瘤的治療效果[7,8]。疾病的進展和治療反應也可通過外泌體的多組分分析來確定。目前正在考慮將表面蛋白、脂質、DNA和miRNA聯合用于癌癥診斷和預后評估，增強診斷的特異性和敏感度。

三、外泌體的活體成像方法

外泌體活體示蹤是用示蹤劑(如有機染料、熒光蛋白、造影劑、核素等)標記外泌體，用特定的影像學方法對動物體內外泌體進行追蹤，從而觀察外泌體在體內的生物學行為。目前常用的活體成像方法包括光學成像、磁共振成像、放射性核素分子成像、光聲成像及多模態成像。

1.光學成像：生物發光成像(bioluminescence imaging，BLI)和熒光成像(fluorescence imaging，FLI)是在可見光光譜(390～700nm)范圍內檢測外泌體的兩種主要的光學成像方法[9]。BLI是由自身合成的熒光素酶催化人為注射的熒光素底物而產生的化學發光成像方法，需要超敏感的CCD相機采集生物發光信號。FLI利用有機染料或熒光蛋白在外部光源的激勵下發出信號而成像。與BLI比較，CCD相機更容易檢測到FLI信號，因此BLI和FLI都可用于外泌體的實時監測。

生物發光成像:生物發光成像可在活體條件下對同一動物體進行連續觀察，其優點是活體實時、無放射性、成像范圍廣。熒光素酶催化熒光素的反應必須要在外源性熒光素及內源性氧氣和ATP存在的條件下，才能在活細胞中進行。Luo等[10]在心肌細胞特異性αMHC增強子后加哺乳動物基因條件性表達載體質粒載體(LoxP-Stop-LoxP)，建立了穩定表達CD63-納米熒光素酶(NanoLuc)報告基因的轉基因小鼠模型，用于時空標記心肌來源的外泌體；并將轉基因小鼠與他莫昔芬誘導的Cre小鼠(CreERT2-Rosa)雜交，獲得他西莫芬誘導表達CD63-NanoLuc報告基因的雜交小鼠模型；最后通過BLI成像研究了心肌細胞外泌體的特異性標記和組織分布情況，為后續的外泌體研究提供了有效工具。然而BLI成像往往需要構建復雜的轉基因細胞株或動物模型，對檢測儀器的精密度也有較高要求。

熒光成像:目前，外泌體熒光成像常以有機染料和熒光蛋白兩種方法標記外泌體(包括外泌體膜和內容物)，以小動物(包括視窗模型動物和模式動物等)為研究對象，借助激光共聚焦顯微鏡和小動物活體熒光成像儀進行外泌體可視化研究[11]。

有機染料標記技術主要用于研究外泌體的細胞攝取及體內分布。常用的有機染料主要包括PKH家族如PKH26/67、Alexa 488/633、Cy3/5/7和Dil/Dio/DiR等。Chen等[12]針對Hela細胞外泌體中的兩種miRNA(mir-21和mir-31)分別制備了兩種分子信標，即Cy5修飾的MB21和Alexa Fluor 488修飾的MB31。然后將CM-Dil膜標記的外泌體與受體細胞孵育，通過單分子定位顯微鏡(single molecule localization microscopy，SMLM)實現了外泌體和miRNA的活細胞動態追蹤，且成功觀察到外泌體在受體細胞間絲狀結構中的移動。然而，這類方法存在染料聚集、內(外)源性雜質混入等造成非特異性熒光信號混淆的缺點。

另一種標記方法是通過熒光蛋白標記外泌體，主要用于研究外泌體釋放、吸收、內容物遞送等過程。Lai等[13]通過插入棕櫚酰化序列的熒光蛋白標記腫瘤細胞膜，研究其分泌的外泌體在體內的動態行為，并通過活細胞共聚焦顯微鏡發現細胞群之間的外泌體交換，通過多光子活體顯微鏡(multi-photon intravital microscopy，MP-IVM)技術完成了對腫瘤脊背視窗模型內外泌體在體可視化觀察，此外還觀察到外泌體內RNA被受體細胞攝取的動態過程。然而，由于熒光蛋白標記效率低、半衰期短，給后期在體成像帶來了一定挑戰。

除視窗模型動物外，模式動物也常用于研究外泌體動態活動，斑馬魚因其個體小、組織層薄、同源性高等特點，成為外泌體活體成像的良好對象。何文慧[14]利用吖啶酮類熒光探針MAA在酸性條件下易與帶負電的外泌體結合，實現了細胞中的外泌體成像；探針能以吞咽和皮膚吸收的方式進入斑馬魚體內，使其頭、腹、尾部均顯示綠色熒光。

2.磁共振成像(MRI)：MRI因其空間分辨率高、無輻射等優點成為外泌體活體示蹤的有效手段之一。外泌體須用MRI造影劑標記以達到成像目的，常用造影劑包括超小順磁性氧化鐵納米顆粒(ultrasmall superparamagnetic iron oxides，USPIO)、釓劑和鐵劑等。Busato等[15]通過創新性標記外泌體使其在MRI成像同時保持形態和生理特征。首先使用4～6nm的USPIO對脂肪干細胞進行標記(200g Fe/ml USPIO，72h孵育)，之后從脂肪干細胞中分離包含USPIO的外泌體，最后實現外泌體的體內和體外MRI成像，成像下限分別為3g和5g外泌體。Liu等[16]設計了一種由鐵蛋白重鏈(FTH1)和內貼蛋白兩部分組成的融合蛋白，其中FTH1用作MRI造影劑；之后用攜帶融合蛋白的慢病毒感染間充質干細胞，并分離外泌體用于動物體內MRI成像。雖然MRI成像分辨率高，但敏感度較低，需大量外泌體才可成像，在技術上存在著很大的挑戰。Jung等[17]用USPIO和奧拉帕尼修飾低氧條件下的乳腺癌腫瘤外泌體，并使用一種新型高敏感度納米顆粒成像技術——磁粒子成像(magnetic particle imaging，MPI)在體內連續成像顯示了外泌體的生物分布情況，同時負載的奧拉帕尼能夠增加細胞凋亡并減慢腫瘤生長。

3.放射性核素分子成像:近年來很多放射性核素分子探針被設計用于外泌體體內成像，如124I、131I、111In-oxine、99mTc-HMPAO、99mTc-三羰基復合物等，并通過單光子發射體層成像(single-photon emission computed tomography，SPECT)、正電子發射體層成像(positron emission tomography，PET)等觀察外泌體的體內生物分布情況。Hwang等[18]用99mTc-HMPAO標記巨噬細胞來源的外泌體，SPECT/CT成像顯示其在小鼠體內多分布于肝臟而腦內無攝取。Faruqu等[19]采用兩種不同方法對黑素瘤細胞產生的外泌體(ExoB16)進行放射標記，即腔內標記(111In-tropolone)和膜外標記(111In-DTPA-anhydride)，結果表明膜外標記的外泌體具有更好的放射標記效率和放射化學穩定性，SPECT/CT成像顯示膜外標記的ExoB16主要積聚在荷瘤小鼠的肝臟和脾臟，而腫瘤部位較少。Shi等[20]創新性地使用PET無創監測銅-64放射性標記聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修飾的外泌體(64Cu-PEG-Exo)，PEG修飾的外泌體在荷瘤小鼠肝內清除率較低而在腫瘤部位大量積累，從而實現了外泌體成像和腫瘤攝取率定量檢測。但該方法會造成輻射損傷，不能清晰顯示解剖學結構，限制了其在生物體內的單獨多次應用。

4.光聲成像(PA):PA是近年來發展起來的一種新型結構和功能成像方式，結合了光學成像和超聲成像的優點，具有高分辨率和高組織對比度，突破了光學成像的深度限制，可實現活體內50mm的深層組織成像。Piao等[21]利用金納米顆粒(GN)標記綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)穩轉的樹突狀細胞，從穩定表達CD63-RFP融合蛋白的4T1細胞系中分離純化紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)標記的外泌體，并通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察樹突狀細胞吸收外泌體的全過程。此外還通過超聲引導的光聲成像敏感且縱向監測經外泌體刺激的樹突狀細胞向腋窩淋巴結轉移的動態活動，表明超聲引導的PA是一種簡單便捷的樹突狀細胞及其內外泌體的無創追蹤成像方式。作為一種新興技術，PA的成像參數如掃描方式、脈沖重復頻率等尚未形成規范化標準，針對不同部位、器官的高分辨率實時光聲成像仍有巨大挑戰。

5.多模態成像:多模態成像結合不同成像方法的特點，如熒光成像(包括近紅外熒光成像，即near-infrared fluorescence，NIRF)、電子計算機斷層掃描(computed tomography，CT)、MRI、PA等，經圖像融合獲得更多的成像細節，提高成像敏感度，其在外泌體成像中應用廣泛。Tayyaba等[22]利用HepG2癌細胞原位生物合成銀和氧化鐵納米團簇(nanoclusters，NCs)，如銀NCs可作為熒光探針，Fe3O4NCs可用作CT和MRI造影劑，自組裝的NCs很容易加載到外泌體上，有望用于生物體內外泌體多模態成像。Abello等[23]用釓劑和近紅外染料標記間充質基質細胞的外泌體，通過MRI/NIFR成像獲得其在注入骨肉瘤小鼠體內24～48h后的生物分布情況。Piao等[24]構建穩定表達CD63-RFP融合蛋白的三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)細胞系，分離其產生的外泌體，通過FLI/PA成像觀察體外條件下和原位TNBC模型中外泌體轉移到巨噬細胞和腫瘤細胞的動態過程。Shaikh等[25]在腫瘤組織中原位生物合成銥和氧化鐵NCs，并分離含NCs的腫瘤外泌體，特異且敏感地經CT/FLI/MRI多模態成像實現腫瘤外泌體的活體示蹤。

四、展 望

針對外泌體納米尺寸及高度特異性的特點，研發的示蹤劑可實現多種分子影像學方法下外泌體的活體示蹤，有利于實時監測外泌體在體內的生物學行為，對于研究外泌體發揮生物學功能和臨床作用的基礎機制具有重要意義，尤其是研究腫瘤外泌體在腫瘤的發生、發展、早期診斷、液體活檢、靶向載藥及療效評估上有著重要價值。然而目前尚缺乏多層次、多模態的外泌體成像示蹤劑，例如適用于外泌體超聲成像的示蹤劑尚未出現，這些示蹤劑的研發始終是研究難點，同樣也是研究熱點。因此未來開發一種用于腫瘤外泌體超聲成像的靶向示蹤劑具有巨大潛能，它有望簡單便捷無輻射地實時監測活體內腫瘤外泌體的動態變化過程，提高早期診斷的敏感度和特異性，同時可以通過監測循環腫瘤外泌體的分布及數量動態評估腫瘤手術治療、化療、放療以及高強度聚焦超聲治療(HIFU)后的療效。相信隨著外泌體活體示蹤分子影像學研究的進一步發展，可以為外泌體的生物醫學應用研究提供更好的方法，促進疾病尤其是腫瘤診療一體化平臺的構建。