ABO血型基因突變導致正反定型不符分析

柳森龍，任 凱，劉 迪，李凌波

ABO血型系統在臨床輸血中具有重要的意義，在臨床常規檢測中常會遇到一些ABO亞型，它們表現為正反定型不一致或抗原、抗體反應強度減弱等。其中A1和A2是血型血清學方法確定的最重要的A型紅細胞亞型，其余不太常見的A亞型包括A3、Ax、Am、Ael等，其A抗原表達逐漸減弱[1]。A亞型的典型血清學特征是在正定型中紅細胞與抗-A和抗-AB血清不發生凝集或僅發生弱凝集，在反定型中A亞型的血清與正常人的A型紅細胞不發生凝集或發生弱凝集，而ABO亞型的分子機制主要是ABO血型基因上堿基的改變。ABO基因有7個外顯子，絕大多數A和B亞型是由第7外顯子中的核酸突變導致糖基轉移酶的催化結構域改變所致。目前國際輸血協會正式命名的ABO等位基因已超過200個，其中等位基因AW有47個(表型分別為Aweak、Ax/Aweak、Afinn/Aweak、Abantu/Aweak)[2-3]。我們在日常血型檢測中發現了1例ABO血型正反定型不符病人樣本，采用成熟的血清學及分子生物學方法，鑒定為Ax/Aweak亞型。現作報道。

1 對象與方法

1.1 研究對象 病人男，51歲，肝病引起消化道出血入院。根據病情需輸血治療，輸血前血型鑒定發現病人ABO正反定型不相符：正定型為A型，樣本紅細胞與單克隆抗-A反應弱陽性，樣本反定型為O型。遂抽取病人血樣本5 mL(EDTA抗凝)進一步鑒定分析。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 血清學實驗 ABODE血型檢測卡，ABO血型反定型試劑紅細胞，不規則抗體檢測試劑紅細胞(長春博迅生物技術有限責任公司)；單克隆抗-A，抗-A1，A2試劑細胞(上海血液生物醫藥有限責任公司)；TD-A型血型血清學用離心機、FYQ型免疫微柱孵育器(長春博研科學儀器有限責任公司)；LDZ4-1.2低速自動平衡離心機(北京雷勃爾離心機有限公司)。

1.2.2 分子生物學實驗 TransStart? FastPfu DNA polymerase快速PCR擴增高保真DNA聚合酶(北京全式金生物技術有限公司)、AxyPrep基因組DNA小量試劑盒(杭州愛思進生物技術有限公司)、QIAquick膠體DNA回收試劑盒、高速離心機(Centrifuge 5415D型，德國Eppendorf)；Mastercycler nexus GX2梯度PCR儀(德國Eppendorf)、凝膠成像系統(Bio-Rad Gel Doc XR+型，美國伯樂)；電泳儀(DYY-8C型，北京市六一儀器廠)；引物合成與基因測序均由吉林省庫美生物科技有限公司完成。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清學實驗 病人ABO血型鑒定按血型檢測卡試劑說明書操作和判讀。樣本紅細胞與抗-A1抗體反應、血清鹽水不規則抗體篩查均采用試管法，均按《全國臨床檢驗操作規程》第四版進行操作與判讀。

1.3.2 分子生物學實驗 DNA提取按照試劑盒說明書提取血液標本基因組。引物設計：ABO基因編碼區共有7個外顯子，其中最大的2個外顯子6和7構成全部編碼區的77%，故在第6、7外顯子設計2對通用引物對目的基因進行擴增，參照美國國立生物技術信息中心GenBank中ABO基因第6、7外顯子編碼區堿基序列在IDT網站設計引物(見表1)，PCR反應條件為95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環，72 ℃延伸10 min，延伸結束后，將上述PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后分析，將目的片段進行膠回收實驗，并以膠回收產物為模板繼續進行PCR擴增，將目的片段送測序，結果以A101(ABO*A1.01)等位基因序列做為參考序列，DNAStar軟件進行序列比對。

表1 第6、7外顯子引物設計

2 結果

2.1 血清學檢測結果 病人樣本血清學結果正定型為A型，樣本紅細胞與單克隆抗-A反應弱陽性(≤2+)，但其紅細胞與抗-A1抗體反應陰性；樣本反定型為O型，血清與A1試劑紅細胞反應弱陽性(≤2+)、與A2試劑細胞反應陰性，其血清鹽水不規則抗體篩查陰性，證實樣本血清存在抗-A1意外抗體(見表2)。

表2 病人樣本血清學檢測結果

2.2 分子生物學檢測結果 ABO基因外顯子6、7序列擴增，瓊脂糖凝膠電泳顯示，第3、4孔在750 bp條帶分別為外顯子7、6擴增條帶(見圖1)。將目的條帶切下并進行膠回收DNA純化后，經過瓊脂糖凝膠電泳檢測結果(見圖2)，第3、4孔條帶分別為外顯子7、6擴增條帶。ABO血型基因直接測序以公認的A101(ABO*A1.01)等位基因序列做為參考序列比對：樣本ABO基因6號外顯子的c.297A>G(見圖3)，氨基酸編碼沒有改變；7號外顯子的c.646 A>T(見圖4)，氨基酸p.Phe216Ile改變；以及c.771T>C(見圖5)，氨基酸編碼沒有改變(見表3)。經過分析該樣本基因型為ABO*AW.30.01。

表3 ABO基因測序結果判定

3 討論

病人ABO血型的正確鑒定是輸血相容性檢測的最重要環節，關系著病人的用血安全，病人在輸血前應常規血清學檢測ABO正定型和反定型，只有正反定型結果一致，才能確定紅細胞ABO血型[4]。但病人ABO血型鑒定會受到年齡、疾病、遺傳等諸多因素的影響，如傳統ABO亞型檢測的血清學方法是通過血清學檢測來確定血型抗原或紅細胞表型，血清學檢測的基礎是檢測可見的血凝或溶血。然而，由于某些藥物暴露于病人紅細胞或存在其他可能改變紅細胞膜的疾病，或是雖然常規單克隆抗體試劑可以識別和凝集弱的亞型，但仍存在定型錯誤的風險。如錯定病人血型，或Ax型供者錯定為O型向O型病人輸血時可能會產生不良后果。另外，如要準確地確定病人ABO血型，或在臨床檢測中出現正反定型不相符，仍需借助分子生物學方法確定病人血型[5-6]。

本文病人樣本正反定型不符為疑難血型，血清學結果正定型為A型，樣本紅細胞與單克隆IgM抗-A反應弱陽性，但其紅細胞與抗-A1抗體反應陰性；樣本反定型為O型，血清與A1試劑紅細胞反應弱陽性、與A2試劑細胞反應陰性，其血清鹽水不規則抗體篩查陰性，證實樣本血清存在抗-A1意外抗體。因此，血清學方法確定為A亞型，疑似為Ax表型。Ax表型的主要血清學特征為：紅細胞與B型人血漿中抗-A不凝集，大多數紅細胞與O型人血漿中抗-AB凝集，與IgM抗-A試劑反應弱；紅細胞只能呈現弱凝集反應，沒有混合凝集；血清中含有抗-A1，可能含有抗-A，血清可與A1細胞反應，也許個別能與A2細胞反應[7-8]。本例樣本ABO血型正反定型不符，疑似亞型，作為病人若按照正定型結果定型為A型，輸入正常A型紅細胞，則病人血漿中存在的抗-A1抗體可能會與輸入的A型供者紅細胞反應，進而有發生嚴重溶血反應的風險，威脅病人輸血安全。

為進一步準確確定病人ABO血型亞型，本研究應用分子生物學檢測進行判定。每一種A亞型的抗原基因都是由多個基因突變后產生的多態性基因，不同A等位基因編碼翻譯出不同的糖基轉移酶，其作用底物都是N-乙酰半乳糖，但所合成的糖鏈其抗原性具有一定差異。目前已發現的A等位基因超過200個，最常見的A基因是ABO*A1.01(A1表型)、ABO*A2.01(A2表型)，主要的基因突變發生在外顯子6、7上[7]。本例ABO血型基因直接測序以公認的A101(ABO*A1.01)等位基因序列做為參考序列比對，樣本測序結果顯示病人在ABO基因第6外顯子出現c.297A>G(ACA>ACG)、第7外顯子出現c.771C>T(CCC>CCT)及c.646T>A(AGT>AGA)出現共3個特異性等位基因突變。ABO基因6號外顯子的c.297A>G及7號外顯子的c.771C>T突變，氨基酸編碼并無改變，屬于無義突變[3]。而通過比對血型抗原基因突變資料庫注冊的ABO表型，分析病人為Ax表型，該表型基因ABO*AW.30.01第7外顯子的c.646T>A突變(導致氨基酸p.Phe216Ile改變)是其表型形成的分子基礎[3,9]。Ax在A型中的頻率分布為法國人約1/77 000，中國人約1/50 000[4]。中國上海CAI等[10]共篩選了322個ABO亞型個體，A型相關表型包括了A3、Aint、Ax、Ael等，得出中國上海檢出率約為0.015%。2018年王鶴[8]分析1例Ax04亞型的血清學特性及分子機制，發現該例正反定型不一致的Ax亞型，其α-1，3-N-乙酰半乳糖胺轉移酶基因c.646T>A突變導致A抗原表達減弱，與本例樣本血清學及分子生物學檢測結果相仿。對于臨床需要輸血的病人而言，準確鑒定ABO血型具有重要意義，Ax亞型往往由于抗原表達極弱血型鑒定困難而導致誤判血型。且Ax亞型病人血漿中常含有抗-A1抗體，可能會導致病人發生溶血性輸血反應，需在確認該抗-A1抗體在37 ℃無反應情況下才能輸入正常A型紅細胞或輸入O型紅細胞，以防止發生輸血不良后果[11]。

根據已有報道[8-9]及本例樣本的鑒定說明，在臨床輸血中包括疑難血型鑒定、紅細胞直抗陽性和多次輸血病人的血型鑒定等諸多方面，僅依靠血清學結果難于確定病人準確血型。因此,有學者建議應用分子生物學的血型基因分型[6]，并認為有助于預防輸血的同種免疫反應，提高輸血的安全性，推動精準醫學的發展。