ORAOV1和Vasohibin1在乳腺癌中的表達及其臨床意義

張莉娜,武世伍

近幾十年來，隨著人們生活方式的改變以及激素的過度使用，乳腺癌的發病率和發病人數在逐年提升，已成為全球發病人數第二高的惡性腫瘤[1]，在我國也是最常見的惡性腫瘤之一[2]。浸潤性乳腺癌(infiltrating breast carcinoma，IBC，非特殊型)是乳腺癌中最常見的組織學類型。盡管近年來各種新的治療方法和技術層出不窮，但IBC病人總的生存時間并沒有顯著提高，這可能與IBC病人術后復發與轉移有關。口腔癌過表達蛋白1(oral cancer overexpressed protein 1，ORAOV1)最初是從口腔鱗狀細胞癌中發現的一個候選癌基因，其定位于人染色體11q13。ORAOV1參與細胞周期、凋亡及血管生成等生物學活動[3-4]。ORAOV1蛋白表達異常增高常常與腫瘤細胞增殖快、分化差、預后不良等密切相關[5]。腫瘤組織通過誘導大量新生血管形成促進其快速生長，并進一步促進其發生浸潤轉移，從而增加病人術后復發和轉移的概率。血管生成抑制因子1(vasohibin 1，VASH1)是近年來才發現的一種關于血管生成的負反饋調節因子[6]，該因子主要是由血管內皮細胞生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子2(FGF2)及血小板源性生長因子(PDGF)等共同刺激血管內皮細胞合成的，并負反饋性地抑制血管生成[7-8]。但是，越來越多的研究[9]表明VASH1高表達卻常常意味著病人預后不良。本研究旨在通過免疫組織化學EliVisionTMplus法尋找能夠預測IBC病人術后浸潤、轉移和預后的生物預測因子，為臨床治療提供一點線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 239例IBC標本(IBC組)和100例相應的癌旁正常乳腺組織(對照組)收集自蚌埠醫學院第一附屬醫院病理科，手術時間為2008-2010年；術前有過新輔助放、化療或生物治療病史的病例均被排除。所有病人均有完整的臨床、病理資料以及術后總的生存時間資料，隨訪時間從手術日期開始，截至2015年12月或死亡(通過打電話、E-mail以及微信等隨訪)。隨訪時間為9～91個月。病人年齡27～77歲。所有入選的IBC組織和正常乳腺組織均經病理科醫師再次閱片證實。

1.2 試劑 兔抗人ORAOV1多克隆抗體(ab211446，濃縮液，稀釋比1∶150)、VASH-1多克隆抗體(ab199732，濃縮液，稀釋比1∶100)購自美國Abcam生物有限公司；EliVisionTMplus及DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司。

1.3 實驗方法 本實驗中所有石蠟包埋標本均經4%中性甲醛溶液固定，再經過連續4 μm厚切片等過程，最后經過二甲苯溶液脫蠟及梯度濃度的乙醇溶液脫二甲苯至水洗。免疫組織化學步驟按照EliVisionTMplus試劑盒說明步驟進行；ORAOV1和VASH1蛋白的染色步驟均根據各自要求進行，陽性對照片用已知陽性切片，空白對照用同種屬的IgG替代。

1.4 結果判定 ORAOV1蛋白陽性染色定位于細胞核，VASH-1蛋白陽性染色定位于細胞質和膜，相應部位出現黃色或棕黃色顆粒為陽性。根據參考文獻[10]中介紹的陽性結果判定依據：將染色強度和染色范圍來分別計分，然后將陽性強度得分和陽性范圍得分相乘，得出一個0～12分的積分值范圍。根據參考文獻中的結果劃分，將積分≥3分判定為陽性，<3分判定為陰性。所有的病理閱片結果均由兩位有經驗的病理醫師通過獨立雙盲法獲得。

1.5 統計學方法 采用χ2檢驗、Speaman等級相關、生存分析(采用Kaplan-Meier方法)及log-rank檢驗。

2 結果

2.1 IBC組織中VASH1蛋白的陽性結果情況及臨床意義 VASH1蛋白在對照組中的陽性率為12.0%(12/100),低于在IBC組的56.9%(136/239)(χ2=57.79，P<0.01)(見圖1A、1B)。對IBC組VASH1蛋白陽性率與臨床病理因素之間的關系分析顯示，與組織的分化程度、TNM分期、淋巴結轉移和腫瘤組織的大小均有關系(P<0.05～P<0.01)，與IBC病人的年齡及腫瘤位置等之間均無相關性(P>0.05)(見表1)。

2.2 IBC組織中ORAOV1蛋白的陽性結果情況及臨床意義 對照組中ORAOV1蛋白的陽性率13.0%(13/100)低于IBC組中58.2%(139/239)(χ2=58.13，P<0.01(見圖1C、1D)。對IBC組ORAOV1蛋白陽性率與臨床病理因素之間的關系分析顯示，與年齡組、腫瘤位置均無關系(P>0.05)，隨著IBC組織的分化越差、腫瘤組織越大，ORAOV1蛋白的陽性率也越高(P<0.01)，淋巴結轉移組中的ORAOV1蛋白的陽性率明顯高于淋巴結無轉移組(P<0.01)，高TNM分期組中的ORAOV1蛋白的陽性率明顯高于低TNM分期組(P<0.01)(見表1)。

表1 IBC中ORAOV1和VASH1的表達及其與臨床各病理因素之間的關系[n；百分率(%)]

2.3 IBC組織中ORAOV1蛋白和VASH1蛋白之間的關系 Spearman相關分析顯示，在IBC組織中ORAOV1蛋白的陽性率與VASH1蛋白的陽性率呈正相關關系(r=0.512，P<0.01)，ORAOV1蛋白的陽性率與ER及PR蛋白之間無相關性(r=-0.089、0.104，P>0.05)，與HER2蛋白呈正相關關系(r=0.131，P<0.05)；VASH1蛋白與ER蛋白呈負相關關系(r=-0.195，P<0.01)，與PR及HER2蛋白無相關性(r=-0.021、0.065，P>0.05)。

2.4 COX多因素回歸分析 將本研究中涉及到所有臨床病理參數,包括年齡、腫瘤長徑、腫瘤位置、分化程度、淋巴結轉移、TNM分期、ER、PR、HER2、ORAOV1及VASH1等因素全部帶入COX多因素模型進行分析，結果表明陽性表達的ORAOV1和VASH1蛋白、腫瘤長徑和TNM分期高低是影響IBC病人術后總生存時間的獨立預后因素(P<0.05～P<0.01)(見表2)。

表2 COX多因素分析

2.5 生存分析 本研究中總的5年生存率約為35.6%(85/239)。Kaplan-Meier法生存分析表明ORAOV1蛋白陽性組中位生存時間為(44.8±15.2)個月，低于陰性組的(61.7±13.6)個月(χ2=53.39，P<0.01)(見圖2A)；VASH1蛋白陽性組為(45.0±14.1)個月，低于陰性組的(61.0±15.6)個月(χ2=49.60，P<0.01)(見圖2B)；ER蛋白陽性組為(53.9±17.7)個月，低于陰性組的(48.6±14.6)個月(χ2=8.98，P<0.01),(見圖2C)；PR蛋白陽性組為(52.0±17.5)個月，與陰性組為(51.7±15.9)個月差異無統計學意義(χ2=0.17，P>0.05)(見圖2D)；HER2蛋白陽性組為(48.0±16.9)個月，低于陰性組的(54.6±16.2)個月(χ2=5.11，P<0.05)(見圖2E)。

3 討論

近年來，罹患乳腺癌的人數不斷增加，且年齡不斷年輕化，因此，迫切需要尋找能早期診斷、預測其浸潤和轉移及預后的分子。ORAOV1是近年來發現的一個新的癌基因，研究表明它是人染色體11q13區域基因擴增的主要驅動因子[3]。在多種腫瘤的發生過程中，ORAOV1在調節腫瘤細胞增殖和血管生成方面起著重要作用[4-5,11-12]。本研究主要通過免疫組織化學方法檢測ORAOV1蛋白在IBC組織及其相應的癌旁正常對照組中的表達情況，發現在IBC組織中ORAOV1蛋白的陽性率顯著高于對照組；且ORAOV1蛋白陽性率的高低差異在IBC組織的不同分化程度、TNM分期高低等之間均有統計學意義；淋巴結轉移組中ORAOV1蛋白的陽性率顯著高于其在淋巴結無轉移組中的，差異也有統計學意義。上述結果表明，ORAOV1蛋白表達的異常增高可能參與了IBC的發生、發展、浸潤及轉移等過程，與其他學者[13-14]的結果相一致。

VASH1是一個由血管內皮細胞產生的特異性的抑制血管新生的蛋白，其位于人染色體14q24.3，包含7個內含子和8個外顯子。VASH1蛋白可以在人體許多器官中表達，但在腦和胎盤組織中最常見。在體外實驗中，VASH1蛋白可以抑制血管內皮細胞增殖、并促使其凋亡[15]；VASH1能夠抑制由VEGF和FGF2誘導的血管形成[6]，并且還可以抑制淋巴管生成[8]。在本研究中，我們發現在IBC組中VASH1蛋白陽性率顯著高于對照組，差異有統計學意義。并且隨著IBC組織的分化越差、腫瘤組織越大，VASH1蛋白的陽性率也越高，差異均有統計學意義；淋巴結轉移組中VASH1蛋白的陽性率顯著高于其在淋巴結無轉移組中，VASH1蛋白的陽性率在高TNM分期組中顯著高于其在低TNM分期組中，差異也均有統計學意義。IBC組織為滿足其快速增殖的需要，分泌大量VEGF和FGF2等因子促進血管形成，而VASH1蛋白的水平主要受到VEGF和FGF2的調控的血管內皮細胞產生，并負反饋性的抑制血管形成，因此VASH1的水平升高反而意味著腫瘤組織增殖快、分化差、易發生淋巴結轉移以及預后差，與文獻[9,13,16]報道一致。

復發和轉移是IBC病人治療失敗最主要的原因。盡管TNM分期能夠為每個病人的治療方案提供一個總的策略，但是其不能全面地反映每個腫瘤病人的異質性及具體的生物學行為，因此，迫切需要尋找到一些能夠預測IBC病人生物學行為及異質性的分子標志物。本研究總的生存分析發現，IBC病人總的5年生存率為35.6%。ORAOV1蛋白、VASH1蛋白和HER2蛋白陽性組IBC病人術后總的生存時間明顯低于其陰性組病人；ER陽性組病人的術后總的生存時間明顯高于其陰性組病人，log-rank分析表明差異均有統計學意義。多因素分析表明陽性表達的ORAOV1和VASH1蛋白、腫瘤長徑及TNM分期高低是影響IBC病人術后總的生存時間的可能獨立預后因素。Spearman等級相關檢測表明ORAOV1和VASH1蛋白的表達呈正相關，且ORAOV1蛋白還與HER2蛋白的陽性表達呈正相關，VASH1蛋白與ER蛋白的陽性表達呈負相關關系，差異均有統計學意義。ORAOV1蛋白表達的異常增高參與了IBC的發生，并促進IBC的快速增殖、浸潤和轉移。在腫瘤的演進過程中，增殖的IBC細胞及其周圍的其他細胞通過分泌VEGF、FGF2和PDGF等因子誘導血管形成，提供充足的營養成分及氧以促進IBC進一步快速增殖，并促使IBC細胞通過新生的血管、淋巴管侵襲、轉移，而VEGF、FGF2及PDGF等同時能夠促進血管內皮細胞合成VASH1，負反饋性的抑制血管形成，從而導致部分腫瘤組織由于生長過快、且又無法獲得足夠的營養和氧而發生壞死。由于病人體內的VASH1水平與VEGF、FGF2及PDGF水平相關，因此VASH1高表達反而意味著預后差。盡管本研究通過免疫組織化學方法得出一些有用的結果，但是手段和方法比較單一，希望在以后的研究中，能通過相關的體內及體外實驗來進一步證實上述結果。

綜上所述，ORAOV1蛋白的異常表達參與了IBC發生，可能與VASH1協同促進IBC的發展、侵襲及轉移等過程。因此，可以通過聯合檢測IBC病人腫瘤組織中ORAOV1和VASH1蛋白表達情況，作為預測其可能發生浸潤、轉移以及預后的可能指標之一。