IL-33及其受體ST2對人卵巢癌ES-2細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

繆晨婷，錢 靜，朱 璟

卵巢癌發病隱匿、不易察覺，多數病人發現時處于中晚期且伴隨轉移[1]，導致多數病人預后不佳[2]。因此提高卵巢癌的早期診斷極為重要。但由于卵巢癌發病機制不明確，要提高早期診斷，還需從卵巢癌的發生機制入手。炎癥在卵巢癌發生、發展中發揮重要作用[3]。白細胞介素(interleukin，IL)是炎性細胞因子重要組成部分，對免疫細胞成熟、增殖、分化等一系列過程具有調節作用。IL-33是IL-1的家族成員，以前體蛋白的形式存在于多種組織細胞核中，磺基轉移酶(sulfotransferase，ST2)是IL-33的高親和力受體[4]。IL-33/ST2信號通路可誘導免疫效應細胞活化，使促癌或抗癌細胞向腫瘤微環境中募集[5]。然而，IL-33在卵巢癌發生、發展的進程機制仍未清楚，是否通過ST2受體發揮作用也未明確。本研究從IL-33從發，探究IL-33/ST2對卵巢癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，旨在進一步揭示卵巢癌發生、發展的分子機制，為卵巢癌的臨床基礎研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑 人卵巢癌細胞系ES-2細胞購自上海生命科學研究院細胞所；IL-33購自英國Abcam公司；DMEM培養基和胎牛血清均購自美國GIBCO公司；胰蛋白酶、脂質體2000均購自賽默飛世爾有限公司；二甲基亞砜購自美國sigma公司；MTT、Transwell小室、Matrigel 基質膠均購自美國Millipore公司；雙染細胞凋亡檢測試劑購自美國Biolegend公司；青鏈霉素雙抗溶液購自江蘇恩莫阿賽生物公司；多聚甲醛和結晶紫染色液均購自碧云天生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將卵巢癌ES-2細胞培養于DMEM培養基(含10%胎牛血清-青鏈霉素雙抗溶液)，置于5%CO2、37 ℃的培養箱內培養，據細胞的生長速率每2天更換培養基，用0.25%的胰蛋白酶每隔2～3 d進行消化、傳代，收集對數生長期ES-2細胞。

1.2.2 MTT實驗 MTT法檢測IL-33和si-ST2對ES-2人卵巢癌細胞后的存活率的影響：取處于對數生長期ES-2細胞，用0.25%胰酶消化后，細胞計數，將ES-2細胞種到6板孔中，密度為3×105/孔，分組為：對照組、IL-33組、IL-33+si-ST2組、si-ST2組，IL-33質量濃度60 ng/L、si-ST2用量為每孔50 pmol。轉染的步驟按照Lipofectamine 2000 的說明書進行操作，24 h后消化細胞，計數，將細胞鋪板到96孔板，加入濃度為60 ng/L的IL-33，在檢測時間點時，每孔加20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，在37 ℃、5%CO2培養箱中培養4 h，避免吸去紫色結晶，每孔加150 μL二甲基亞砜，進行10 min低速振蕩，使結晶物充分溶解，采用酶聯免疫監測儀對波長490 nm時每個孔的吸光度實施測定，每組重復3次，取平均值。

1.2.3 流式細胞術實驗 取對數生長期ES-2細胞，0.25%胰蛋白酶消化細胞，調整細胞密度，將ES-2細胞種到6孔板中，孔密度2.5×105，按照分組進行轉染si-ST2，轉染的步驟按照Lipofectamine 2000 的說明書進行操作。轉染24 h后，加入60 ng/L的IL-33。48 h后收集細胞，4 ℃預冷PBS洗滌2次，然后用500 μL結合緩沖液重懸細胞，調節其濃度為106/mL，取100 μL細胞懸浮于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-APC混勻后，加入5 μL Propidiμm Iodide(PI)混勻，于室溫避光孵育15 min，采用流式細胞術檢測細胞凋亡率。

1.2.4 細胞遷移實驗 接種ES-2細胞至24孔板，待細胞貼壁鋪滿后利用槍頭劃痕，分別加入IL-33(60 ng/L)、si-ST2(每孔50 pmol)刺激后，分別在0、24 h時間點取樣，拍照。在Adobe Illustrator(AI)軟件里面量出不同時間不同分組劃痕的寬度；細胞遷移率=(0 h細胞間距-24 h細胞間距)/0 h細胞間距×100%。

1.2.5 細胞侵襲實驗 接種ES-2細胞至Matrigel基質膠(9∶1)，Matrigel稀釋液平鋪于Transwell 小室上室，下室加入含有10%胎牛血清的培養液(600 μL)，上室分別加入IL-33(60 ng/L)、si-ST2(每孔50 pmol)刺激10 h后，去除上層未穿過濾膜的細胞，保留濾膜下層細胞，甲醇固定，結晶紫染色，顯微鏡視野下拍照細胞計數。

1.3 統計學方法 采用t檢驗和方差分析。

2 結果

2.1 MTT實驗檢測si-ST2對IL-33作用ES-2卵巢癌細胞的影響 IL-33組、si-ST2組、IL-33+si-ST2組以及對照組的細胞存活率的比較，差異有統計學意義(P<0.01)。其中IL-33組細胞存活率高于對照組(P<0.01)，si-ST2組細胞存活率低于對照組(P<0.01)；但IL-33+si-ST2組細胞存活率與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。IL-33+si-ST2組細胞存活率顯著高于si-ST2組；IL-33組細胞存活率顯著高于si-ST2組(P<0.01)(見表1)。

表1 不同組間細胞存活比較

2.2 流式細胞術檢測IL-33和si-ST2對ES-2卵巢癌細胞凋亡的影響 對照組、IL-33組、si-ST2組以及IL-33+si-ST2組流式細胞儀結果顯示，在ES-2細胞中，IL-33組細胞凋亡率低于對照組；si-ST2組細胞凋亡率高于對照組和IL-33組；IL-33+si-ST2組細胞凋亡率低于si-ST2組，高于IL-33組(見圖1、表2)。

表2 ES-2凋亡數據表(%)

2.3 IL-33和si-ST2對ES-2卵巢癌細胞遷移、侵襲的影響 IL-33組、si-ST2組、IL-33+si-ST2組以及對照組的細胞遷移率、侵襲率的比較，差異有統計學意義(P<0.01)，其中IL-33組細胞遷移率、侵襲率均低于對照組，si-ST2組遷移、侵襲均高于對照組，IL-33+si-ST2組遷移、侵襲均高于IL-33組，低于si-ST2組，差異均有統計學意義(P<0.01)(見圖2、圖3及表3)。

表3 不同組間細胞遷移率、侵襲率的比較

3 討論

腫瘤發展不僅包括癌細胞本身，還有其他相關組成部分，如基質細胞、炎癥細胞，特別在卵巢癌腹水和基質交換過程中，會伴隨淋巴細胞群的相關因子變化，促進癌細胞生長、擴散[6]。另外癌細胞本身產生的炎性細胞因子也能通過自分泌方式，促進其本身增長，抑制凋亡。可見，炎癥似乎和腫瘤的每一步都有關聯，包括腫瘤細胞增殖、調亡、遷移、侵襲[7]。因為炎性因子的刺激，會造成線粒體損傷，降低細胞內的抗氧化活性，增加活性氧的產生，破壞生物大分子(DNA、蛋白質)，導致正常細胞轉化為惡性細胞[8]，當細胞的基因發生點突變、缺失或重組，即可誘發腫瘤[9]。IL-33作為新發現的促炎細胞因子，可通過IL-33/ST2信號通路，作用于含有ST2受體的細胞，誘導其分泌相關細胞因子和趨化因子，發揮促增殖作用。有文獻[10]表明IL-33和ST2在卵巢腫瘤中表達上調。胡霞等[11]研究表明IL-33可促進食管腺癌細胞的增殖，其機制是IL-33通過IL-33/ST2信號通路，作用于含有ST2受體的細胞，誘導其分泌相關炎性因子，發揮促癌細胞增殖、遷移作用。LI等[12]研究表明IL-33可促進大腸癌細胞的增殖，其機制是IL-33通過其受體ST2發揮作用，同時經NF-κB信號上調環氧化酶2的表達，促進大腸癌細胞的增殖、遷移。這些研究均表明IL-33是通過ST2通路發揮促癌細胞發展作用,但其在卵巢癌的作用尚不清楚。

本研究采用MTT實驗發現IL-33組細胞存活率高于對照組，si-ST2組細胞存活率低于對照組，IL-33+si-ST2組細胞存活率顯著高于si-ST2組；IL-33組細胞存活率顯著高于si-ST2組(P<0.01)。表明了IL-33促進ES-2卵巢癌細胞增殖，si-ST2抑制增殖，轉染si-ST2后再加入IL-33處理后，細胞增殖能力恢復。在流式細胞術檢測IL-33和si-ST2對ES-2卵巢癌細胞凋亡的影響結果發現，IL-33處理組細胞凋亡率低于對照組；si-ST2組細胞凋亡率高于對照組和IL-33組；IL-33+si-ST2組細胞凋亡率低于si-ST2組，高于IL-33組(P<0.01)。表明了在卵巢癌ES-2細胞中，IL-33抑制細胞凋亡，si-ST2促進細胞凋亡。本研究的遷移、侵襲實驗發現IL-33組細胞遷移率、侵襲率均低于對照組，si-ST2組遷移、侵襲均高于對照組，IL-33處理+si-ST2組遷移、侵襲均高于IL-33處理組，低于si-ST2組(P<0.01)。IL-33可促進卵巢癌細胞增殖，并可抑制卵巢癌細胞凋亡、遷移和侵襲能力。而沉默ST2可抑制細胞增殖，并促進卵巢癌細胞凋亡、遷移和侵襲能力，ST2沉默處理后再加入IL-33處理，細胞增殖能力恢復，而細胞凋亡、遷移和侵襲能力受到抑制。說明在卵巢癌ES-2細胞中，IL-33對其生物學特性的影響是通過ST2受體途徑而實現的。究其原因：IL-33在腫瘤微環境下，被分泌到胞外與受體ST2 結合，通過IL-33/ST2信號通路作用于腫瘤微環境中的含有ST2 受體的細胞，誘導其分泌相關細胞因子和趨化因子[13]。同時將信號轉到細胞內，把MyD88蛋白招募過來[14]，并通過MyD88通路的IRAK1、IRAK4和TRAF6，降解IκB蛋白(NF-κB的抑制性蛋白)，隨后激活NF-κB、MAPK、p38以及c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和細胞外調節激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)[13，15]，同時激活下游轉錄因子激活子蛋白-1(Activator protein 1,AP-1)。NF-κB是一種可與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強子κB序列特異性結合的核蛋白因子[16]，具有多向性轉錄調節作用，當活化的NF-κB與相應κB序列結合后，啟動和調節增殖相關基因的轉錄；MAPK通路是細胞增殖、凋亡等信號的轉導途徑；而p38途徑通過上調某些轉錄因子基因的表達，則會影響癌細胞的增殖，JNK途徑中活化的JNK與激活轉錄因子2(ATF2)及c-Jun的氨基末端區域結合，使轉錄因子的活性區域發生磷酸化[17]，JNK的同二聚體或異二聚體與基因啟動子上的AP-1 位點結合，提高AP-1轉錄活性，促進基因表達和蛋白質的合成，使內皮細胞活化，腫瘤細胞更容易穿透內皮，介導細胞與細胞間、或細胞與基質間相互接觸或結合，從而參與腫瘤遷移、侵襲等過程。這也說明了IL-33是可促進卵巢癌細胞增殖，但ST2沉默后，IL-33無法與ST2受體結合發揮促增殖作用，因此si-ST2屬促進卵巢癌細胞凋亡。

綜上，IL-33可促進卵巢癌ES-2細胞增殖并抑制其凋亡、遷移、侵襲，沉默ST2可抑制卵巢癌ES-2細胞增殖并促進其凋亡,使其遷移和侵襲能力下降，ST2沉默處理后再加入IL-33處理，細胞增殖能力恢復，但細胞凋亡、遷移和侵襲能力受到抑制。IL-33通過ST2途徑參與影響卵巢癌ES-2細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲。