雷公藤甲素對IgA腎病大鼠的腎保護作用及對NLRP3炎癥小體的影響

周 慧，曲頌揚，田立東

免疫球蛋白A腎病(IgAN)是世界上最常見的腎小球腎炎形式之一，也是終末期腎病的主要原因[1]。25%～30%的IgAN病人需要在20～25年內進行腎臟替代治療，另外20%～40%的病人在發病后20年內會發生終末期腎病[2-3]。其以血尿和蛋白尿為主要臨床表現，病理特征包括腎小球系膜細胞增生并伴有以IgA為主的免疫復合物的沉積[4]。腎移植和透析的成本已成為病人和社會的巨大財務負擔[5]。因此，開發用于治療IgAN的有效藥物是十分重要的。雷公藤甲素(triptolide,TR)是中藥雷公藤的主要活性成分之一，具有抗炎、抗凋亡及免疫調節等作用[6]，對大鼠腎缺血再灌注損傷、糖尿病腎損傷及慢性腎衰均具有保護作用[7-9]。并且其對于IgAN及系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的治療效果也較為突出，但是其具體治療機制目前尚不明確。NLRP3是近幾年發現的重要的炎癥復合體之一，其能觸發Caspase-1、白細胞介素(IL)-1β和IL-18的成熟以執行炎癥反應[10-11]。并且有研究[12-13]已經證實，IL-1β和IL-18是NLRP3炎癥小體激活的兩個關鍵標志物，在IgAN病人血清和尿液中表達升高，提示NLRP3炎癥小體可能通過調節炎癥在IgAN中發揮重要作用。本研究通過建立IgAN大鼠模型，觀察雷公藤甲素對IgAN大鼠的治療作用，并且從NLRP3炎癥小體方面探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 SPF級雄性SD大鼠40只，體質量(200±10)g，購于遼寧長生生物有限公司[SCXK(遼)：2012-0001]，動物分籠飼養，室溫維持在 20～25 ℃，每日光照12 h。大鼠被隨機分為4組：對照組、模型組、雷公藤甲素低劑量組(100 μg/kg)及雷公藤甲素高劑量組(200 μg/kg)，每組10只大鼠。

1.2 藥材及試劑 雷公藤甲素標準品購自成都普菲德生物技術有限公司，腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-17A、γ干擾素(IFN-γ)和IL-4 ELISA試劑盒購自上海朗頓生物技術公司，鼠抗β-actin、兔抗IL-1β、 Caspase-1、 IL-18、NLRP3、IgA及β-actin抗體購自Abcam公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記兔抗鼠、HRP標記羊抗兔二抗購自北京博奧森有限公司，Cy3標記羊抗兔二抗購自Jackson公司，全蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物有限公司，BCA 蛋白定量試劑盒購自碧云天生物有限公司，其他試劑均為國產分析純試劑。

1.3 儀器 石蠟切片機(德國徠卡公司)，AV5800型全自動生化分析儀(Beckman Coulter公司)，紫外可見分光光度計(上海元析公司)，Nikon熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司)，酶標儀(深圳邁瑞公司)，水平核酸電泳儀、半干式蛋白轉膜儀(Bio-Rad)。

1.4 IgAN大鼠模型的建立 按文獻[14-15]報道的方法建立IgAN大鼠模型，通過連續8周口服0.1%牛γ-球蛋白(BGG)溶液及連續3 d尾靜脈注射1 mg BGG的方法制備IgAN模型。對照組大鼠給予等體積0.9%氯化鈉溶液。隨后將模型制備成功的大鼠隨機分為模型組、雷公藤甲素低劑量(100 μg/kg)及高劑量(200 μg/kg)組，每組10只。各組大鼠連續灌胃給藥8周，每天1次，對照組及模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液[16-17]。

1.5 大鼠生化指標檢測 將大鼠置于代謝籠內收集24 h尿液，5 000 r/min離心10 min，取上清液檢測24 h UTP。末次給藥1 h后各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，經腹主動脈采血，10 000 r/min離心10 min分離血清，利用自動生化分析儀檢測鼠血清中肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、總蛋白(TP)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)及天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)含量和尿液中24 h 尿蛋白(24h UTP)水平。

1.6 ELISA檢測 ELISA法檢測血清中TNF-α、 IL-17A、IFN-γ及 IL-4 水平，按照試劑盒說明書進行操作。加入樣品、生物素標記的抗體、鏈霉親和素-HRP，37 ℃孵育30 min。加入顯色液，37 ℃避光顯色30 min，終止顯色；以酶標儀在450 nm波長下檢測吸光度值，根據不同濃度標準品的OD值繪制標準曲線，得到回歸方程，根據回歸方程計算樣品中TNF-α、IL-17A、 IFN-γ及 IL-4 水平。

1.7 免疫熒光染色 石蠟切片經過二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，經過高溫抗原修復后，1% Triton X-100透化30 min，PBS洗滌；滴加適量5% BSA溶液封閉60 min；滴加兔抗IgA抗體稀釋液(1∶500)，4℃孵育過夜，PBS洗滌；滴加Cy3標記的羊抗兔二抗稀釋液(1∶500)室溫避光孵育1 h，PBS洗滌，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 Western blotting檢測 提取各組大鼠腎組織總蛋白，12 000 r/min離心10 min，使用考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量分析，100 ℃加熱10 min對蛋白進行變性，隨后進行SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳，使用PVDF膜轉膜，5%脫脂奶粉封閉液封閉，TBST洗膜，分別加入β-actin、兔抗IL-1β、 Caspase-1、IL-18、NLRP3及β-actin一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入相應HRP標記二抗稀釋濃度為1∶1 000，室溫避光孵育1 h。TBST洗膜，ECL發光試劑盒發光，凝膠成像系統成像，Image J軟件計算灰度值，統計分析目的條帶與內參蛋白條帶光密度的比值。

1.9 統計學方法 采用單因素方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 雷公藤甲素對IgAN大鼠生化指標及24 h TUP的影響 與對照組相比，模型組血清中Scr、BUN及尿液中24 h TUP含量明顯升高(P<0.05～P<0.01)；經不同劑量雷公藤甲素治療后，血清中Scr、BUN及尿液中24 h TUP含量均明顯降低(P<0.05～P<0.01)；但各組大鼠血清中TP、ALT及AST水平無明顯變化(P>0.05)(見表1)。

表1 生化指標及24 h UTP含量變化的比較

2.2 雷公藤甲素對IgAN大鼠炎癥因子及對腎組織IgA沉積的影響 與對照組相比，模型組IgAN大鼠血清中炎癥因子TNF-α、 IL-17A、 IFN-γ和IL-4 水平明顯升高(P<0.05～P<0.01)；雷公藤甲素低、高劑量組均能不同程度的降低大鼠血清中TNF-α、 IL-17A、IFN-γ和IL-4 水平(P<0.05～P<0.01)(見表2)。對照組少見IgA免疫球蛋白的沉積，而模型組腎小球IgA免疫球蛋白沉積明顯(P<0.01)，雷公藤甲素治療組IgA免疫球蛋白的沉積情況明顯減輕(P<0.01)(見圖1)。

表2 腎組織中炎癥因子水平的比較

2.3 雷公藤甲素對腎組織IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3蛋白的影響 與對照組相比，模型組腎組織中IL-1β、Caspase-1、IL-8及NLRP3蛋白的表達明顯升高(P<0.05～P<0.01)；雷公藤甲素治療后，腎組織中IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3蛋白的表達明顯降低(P<0.05～P<0.01)(見圖2、表3)。

表3 腎組織中IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3蛋白的相對表達

3 討論

IgAN是全球公認的引起腎小球腎炎的最常見的免疫復合物，IgAN的唯一診斷特征是在腎活檢中發現腎小球系膜內主要含有聚合IgA的免疫沉積物[18]。IgAN的發病機制目前還不十分明確，大量的臨床數據及基礎研究均表明，IgAN主要以IgA為主的免疫復合物在腎小球系膜細胞及基質沉積后，通過激活多種細胞因子及信號通路，引發免疫反應過程，導致腎小球硬化、腎小管間質纖維化等，最終造成腎功能衰竭[19]。因此，如何抑制IgA的沉積是緩解IgAN進展、改善預后的關鍵靶點。

近幾年，中醫中藥在IgAN中的作用逐漸被重視，王騫等[20]利用滋陰涼血湯治療IgAN大鼠模型，滋陰涼血湯能減少IgA腎病大鼠尿液中紅細胞數量、尿蛋白，改善腎小球內系膜基質、細胞增生和腎小管萎縮及炎癥反應等病理改變。活血通絡清熱利濕方能夠抑制IgA腎病大鼠腎組織IL-13、IL-4 mRNA的表達及血清循環免疫復合物的分泌，延緩疾病發展，保護腎功能[21]。潘立軍等[22]發現補腎調肝化瘀法聯合西醫基礎治療氣陰兩虛型IgAN，與單獨西醫基礎治療相比可更有效減輕中醫癥候，改善病人臨床癥狀。YANG等[23]發現中藥蟬蛻能夠通過抑制炎癥和細胞凋亡來改善IgAN大鼠的腎臟炎癥和纖維化。

中藥雷公藤為衛矛科雷公藤屬木質藤本植物，主要功效為祛風除濕、活血通絡、清熱解毒等。雷公藤甲素為其主要藥理成分，具有廣泛的藥理作用，已經證實其具有抗炎、免疫調節、抗腫瘤等作用。研究[24]表明雷公藤甲素能夠抑制α平滑肌肌動蛋白、TGF-β1的表達來抑制腎纖維化的進展。雷公藤甲素能有效降低IgAN病人外周血單個核細胞中TNF-α、IL-6、一氧化氮的含量并促進其凋亡，發揮改善作用[25]。但是對于雷公藤甲素改善IgAN的具體作用機制，還未見報道。本研究利用BGG溶液及給予BGG的方法制備IgAN模型，觀察雷公藤甲素對IgAN大鼠的保護作用并對其作用機制進行了探討。

Scr是人體肌肉終產物，BUN是體內的一種含氮化合物，在正常生理狀態下，Scr和BUN由腎小球濾過而排出體外，體內Scr和BUN含量處于低水平狀態，而在IgAN病人或其他腎功能不全疾病狀態下，腎小球濾功能障礙，因此血清中Scr和BUN含量將明顯升高[26]。當腎小球功能及泌尿功能受損后，將造成大量蛋白質漏出，導致尿中出現大量蛋白質，因此檢測24 h UTP也可反映出腎小球功能是否正常[27]。本研究發現雷公藤甲素治療后，大鼠血清中Scr、BUN及尿液中24 h UTP水平明顯降低，而對TP、ALT及AST水平無影響，說明雷公藤甲素能夠改善IgAN大鼠腎小球濾過功能。

近年來，普遍認為IgAN的發生發展與輔助性T淋巴細胞1與輔助性T淋巴細胞2的比例(Th1/Th2)失衡有關。Th1細胞主要分泌IFN-γ、TNF-α等細胞因子，促進B細胞分泌產生可強烈激活補體的IgG亞型，Th2細胞主要分泌IL-4、IL-17等細胞因子，可激活嗜酸性粒細胞，促進B細胞分泌不激活補體的IgG亞型[28]。NAGAKI等[29]發現在自發性產生IgA的小鼠中，幼鼠主要以Th1為主，而隨著IgA產生沉積增加，Th2則呈現出優勢地位，因此認為IgA的產生可能與Th1/Th2平衡向Th2偏靠有關。有研究[30]證實IFN- γ、TNF-α及IL-4等細胞因子在IgA腎病模型中表達增多，且中晚期IgAN病人的炎癥因子表達水平較早期病人高，提示Th1/Th2 分泌的細胞因子參與了IgAN特異的炎癥反應和免疫損傷過程，并且炎癥因子的水平可以直觀反映IgAN的病情。本研究利用ELISA檢測各組大鼠血清中TNF-α、 IL-17A、IFN-γ和IL-4的表達，結果顯示，雷公藤甲素能夠顯著降低大鼠血清中TNF-α、 IL-17A、IFN-γ和IL-4水平；同時免疫熒光染色結果發現，雷公藤甲素能夠降低大鼠腎組織中IgA的熒光強度，減少IgA的沉積，以上結果說明雷公藤甲素能夠通過調節Th1/Th2平衡來抑制腎組織中IgA的沉積，改善腎功能。

NLRP3炎癥小體是炎癥反應的核心復合物之一，IgA作為NLRP3炎癥小體激動劑，可通過線粒體損傷釋放活性氧進而激活NLRP3引起炎癥級聯反應[31]，在動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病及糖尿病腎病等自身免疫性疾病中發揮重要作用。NLRP3炎癥小體主要通過溶酶體破裂方式、半通道方式及活性氧方式激活?；罨蟮腘LRP3炎癥小體可招募ASC、Caspase-1形成NLRP3炎癥復合體，進而活化Caspase-1，活化后的Caspase-1可以使無活性的IL-1β、IL-18前體加工成為有活性的細胞因子，并分泌到細胞外，參與一系列的炎癥反應[31]。有研究[32-34]表明，淫羊藿苷可通過抑制NF-κB介導的NLRP3炎癥小體激活來改善IgAN大鼠的腎損傷；白藜蘆醇還可以通過保持線粒體完整性和增強自噬來抑制NLRP3炎性體激活，從而改善IgAN大鼠的腎功能。為了探討雷公藤甲素改善IgAN大鼠的腎功能的機制，我們利用Western blotting檢測了腎組織中IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3蛋白的表達，結果發現，雷公藤甲素能夠顯著降低IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3蛋白的表達，說明雷公藤甲素改善IgAN大鼠的腎功能可能與抑制NLRP3炎癥小體的活化有關。

綜上所述，雷公藤甲素改善IgAN大鼠的腎功能、抑制IgA沉積，可能與抑制NLRP3炎癥小體的活化有關，為雷公藤甲素用于IgAN臨床治療提供了理論和實驗依據。本研究雖初步探討了雷公藤甲素治療IgAN大鼠的可能機制，但并未深入利用基因敲除或者抑制劑等手段加以證明，本課題組將在后續的實驗中對雷公藤甲素的治療機制進行深入探討。