基于系統(tǒng)藥理學鴉膽子治療肺癌作用機制的研究▲

黃志漢 黎文杰 鄭景輝

(1 廣西大新縣中醫(yī)醫(yī)院呼吸內(nèi)科，大新縣 532300，電子郵箱：huangzhihan163@163.com；2 廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院心內(nèi)科，南寧市 530000)

據(jù)國家癌癥中心統(tǒng)計，2019年我國肺癌發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤首位，其中新發(fā)病例約78.1萬，死亡病例約62.6萬[1]。目前肺癌的主流治療方案仍是以化療為主的綜合治療方案，但由于耐藥性強等原因治療效果并不理想[2]。中藥因具有高效、低毒、多靶點的優(yōu)勢，在肺癌耐藥性研究中優(yōu)勢日益明顯[3]。鴉膽子為苦木科植物鴉膽子的干燥成熟果實，具有清熱解毒、截瘧、止痢的功效。現(xiàn)代藥理學研究表明，鴉膽子具有廣泛的抗癌作用，并可以抑制腫瘤的轉移[4]。但是由于中藥多因、多效、多靶點的特點，鴉膽子治療癌癥的具體作用機制尚未被闡明。本研究利用系統(tǒng)藥理學方法綜合闡釋鴉膽子治療肺癌的可能機制。

1 資料與方法

1.1 鴉膽子的化學成分 本研究采用藥代動力學特征和毒性計算方法，借助中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索鴉膽子所有化學成分，以口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18篩選鴉膽子的活性成分，最后得到相關化合物以及其相關靶點。將靶點名稱輸入UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中統(tǒng)一為規(guī)范基因名；剔除不同化合物預測產(chǎn)生的相同靶點，得出鴉膽子化合物潛在靶點信息。

1.2 蛋白質互相作用網(wǎng)絡的構建 將1.1所得的靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫v10.5(http://string-db.org)，選擇以人為分類的物種，設定打分值為高置信度0.7，隱藏斷裂節(jié)點，得出蛋白質互相作用(protein-protein interaction,PPI)信息，將得到的數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.6.1軟件構建鴉膽子化合物靶點PPI網(wǎng)絡。

1.3 鴉膽子治療肺癌潛在靶點篩選 本研究基于GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)綜合篩選與肺癌相關的靶點，具體操作如下：以“l(fā)ung cancer”作為關鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫中查詢，初步篩選出20 650個候選基因，根據(jù)“Reference Count”值取相關度大于30的靶點。將構建的肺癌相關靶點數(shù)據(jù)庫與鴉膽子化合物潛在靶點進行對比分析，并利用Venny 2.1在線工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/)繪制韋恩圖，篩選出鴉膽子治療肺癌的潛在靶點。

1.4 鴉膽子治療肺癌潛在靶點的連通特性 根據(jù)1.1和1.3的預測結果,利用Cytoscape 3.6.1軟件中的Merge功能,將兩個預測結果合并成化學成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖,進行全局化可視網(wǎng)絡分析；并通過Cytoscape 3.6.1軟件的Network analysis插件計算網(wǎng)絡的拓撲參數(shù),分析其相互關系。網(wǎng)絡中節(jié)點(node)之間如存在調控作用關系則以邊(edge)相連。本研究通過平均最短路徑、介數(shù)中心性、中心接近度、聚類系數(shù)和連通度等參數(shù)來評估節(jié)點在全網(wǎng)絡中的關鍵性。

1.5 生物學功能和通路富集分析 將鴉膽子作用于肺癌潛在相關靶點的官方簡寫上傳到DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)中，依次勾選OFFICIAL_GENE_SYMBOL(官方基因標志)、Gene list、Submit list,修改背景和物種為人類進行基因本體(Gene Ontology，GO)分析。選擇“KEGG-Pathway”得到京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析相關數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)導入GraphPad Prism 7.0軟件進行可視化分析。

2 結 果

2.1 鴉膽子的活性成分及其潛在靶點間的的PPI網(wǎng)絡圖 共得到13個鴉膽子的化學成分，包括β-谷甾醇、鴉膽子素、矢車菊甙、木犀草素、鴉膽子苷等，見表1。刪除無相關對應靶點的化學成分，得到鴉膽子有效活性成分2個，分別為β-谷甾醇和木犀草素，共分析得到48個最終潛在靶點進行下一步研究。鴉膽子有效化合物靶點圖及其PPI網(wǎng)絡分別見圖1、圖2。

表1 鴉膽子的化學成分

圖1 鴉膽子化合物靶點圖

圖2 鴉膽子作用靶點的PPI網(wǎng)絡圖

2.2 鴉膽子治療肺癌的潛在靶點 共獲得321個肺癌相關靶點。將48個鴉膽子的潛在靶點與肺癌靶點進行對比分析，得到鴉膽子治療肺癌的20個潛在靶點，分別為TP53、JUN、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、白細胞介素(interleukin，IL)-6、基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotein，MMP)2、前列腺素g/h合酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)、雄激素受體(androgen receptor，AR)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HMOX1)、孕酮受體(progesterone receptor，PGR)、干擾素γ(interferon gamma，IFN-γ)、MMP1、IL-2、細胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)、肝細胞生長因子受體MET、視網(wǎng)膜母細胞瘤相關蛋白RB1、谷胱甘肽S-轉移酶P1(glutathione S-transferase P1，GSTP1)、DNA拓撲異構酶1(DNA topoisomerase 1，TOP1)、B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma 2，BCL-2)，重合率為5.7%，見圖3。鴉膽子對肺癌作用靶點的蛋白互作網(wǎng)絡見圖4。經(jīng)拓撲學分析，發(fā)現(xiàn)這20個潛在靶點在全局性關系網(wǎng)絡中體現(xiàn)了較好的連通特性。見表2。

圖3 鴉膽子的潛在靶點與肺癌作用靶點的韋恩圖

圖4 鴉膽子-肺癌作用靶點的PPI網(wǎng)絡圖

表2 20個鴉膽子-肺癌作用靶點的拓撲學分析

2.3 鴉膽子治療肺癌潛在靶點的生物學功能和通路分析 將20個鴉膽子治療肺癌潛在靶點上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫中進行GO分析和KEGG分析。GO分析結果得到7個生物學過程、11個細胞組成、22個分子功能，見圖5；通路富集KEGG分析獲得37條鴉膽子治療肺癌潛在靶點的通路，見圖6。

圖5 鴉膽子-肺癌作用靶點的GO分析結果

圖6 鴉膽子-肺癌作用靶點的KEGG富集分析結果

2.4 鴉膽子治療肺癌潛在靶點分子對接結果 系統(tǒng)分子對接結果顯示，有4個靶點的DS值>7.0，超過90%靶點的DS值>5.0，說明鴉膽子主要化學成分β-谷甾醇與木犀草素對鴉膽子治療肺癌潛在靶點有較好的結合活性。見表3。

表3 鴉膽子治療肺癌潛在靶點分子對接結果

3 討 論

中醫(yī)上認為腫瘤的發(fā)生多是由于邪毒趁機體正氣虛弱之時侵入，引起臟腑功能失調，機體氣滯血瘀時間過長，逐漸誘發(fā)腫塊形成。放化療治療雖可腫瘤產(chǎn)生一定作用，但副作用過大，對機體損害大，甚至可引起攻邪傷正發(fā)生，嚴重影響患者的生存質量[6]。中醫(yī)藥輔助治療肺癌副作用較小，但是中藥的具體成分難以簡單辨別，具體作用機制也難以清楚闡釋。系統(tǒng)藥理學協(xié)同起效的觀念與中醫(yī)上“整體觀”相吻合。本研究采用系統(tǒng)藥理學方法，利用化合物映射靶點的方法系統(tǒng)探究鴉膽子治療肺癌的具體作用機制。

本研究篩選出β-谷甾醇、鴉膽子素、木犀草素、鴉膽子苷等鴉膽子的主要化學成分，且得到48個最終潛在靶點。現(xiàn)代藥理學研究表明，鴉膽子素是鴉膽子中發(fā)揮抗腫瘤作用的主要成分，其中單體鴉膽子素D不僅能夠誘導胰腺癌細胞的凋亡，還能夠抑制結腸癌細胞的增殖并誘導其凋亡[7-8]。β-谷甾醇作為廣譜抗癌成分，在治療乳腺癌、結腸癌、前列腺癌方面均具有較好的療效[9]。林明珠等[10]在小鼠實驗研究中發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇可通過介導IL-6、IFN-γ和VEGF表達促進腫瘤組織細胞的凋亡。木犀草素對非小細胞肺癌細胞的轉移及侵犯具有良好的抑制作用[11]。周亮等[12]發(fā)現(xiàn)，木犀草素可顯著降低CD8+T淋巴細胞水平，降低肺組織中表皮生長因子、轉化生長因子β、VEGF的表達及蛋白激酶B1、細胞周期蛋白D1、核因子κB mRNA的表達水平，提高肺組織中PTEN蛋白的表達，降低磷脂酰肌醇3-激酶、磷酸化蛋白激酶蛋白B表達水平，提示木犀草素可顯著抑制肺癌的增殖和轉移。

在對鴉膽子作用于肺癌的相關靶點進行篩選時，發(fā)現(xiàn)有20個鴉膽子有效化合物的潛在靶點與肺癌靶點重合；將這20個靶點進行GO、KEGG分析，結果顯示，有7個生物學過程、11個細胞組成、22個分子功能及37條通路參與鴉膽子作用于肺癌的過程，包括癌癥中的微小RNA、癌癥的信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路、低氧誘導因子1α信號通路等都與肺癌具有高度相關性。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路在非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中具有雙重作用：一方面通過促進腫瘤細胞增殖和遷移導致腫瘤進展；另一方面通過參與免疫抑制微環(huán)境的形成介導腫瘤細胞的免疫逃逸[13]。該通路抑制劑通過對抗免疫抑制的形成，重塑腫瘤免疫微環(huán)境，抑制腫瘤進展[14]。由于腫瘤細胞具有很強的增殖、轉移能力，容易導致血液供應不足，此時腫瘤細胞會上調低氧誘導因子1α表達來維持腫瘤細胞的增殖代謝，從而適應缺氧微環(huán)境[15]。低氧誘導因子1α能通過調節(jié)多種靶基因的轉錄來影響腫瘤細胞的代謝、增殖、凋亡，使得腫瘤細胞更好地適應缺氧微環(huán)境；同時其還具有促進腫瘤血管生成、增加侵襲轉移能力以及提高對放化療抵抗的作用等[16]。此外，癌癥中的微小RNA在肺癌的發(fā)生中也具有重要作用[17]。

在分子對接模擬結合力驗證中，HMOX1、GSTP1、CDK4與β-谷甾醇、木犀草素模擬結合力較強，提示HMOX1、GSTP1、CDK4基因在鴉膽子治療肺癌的過程中可能具有重要研究意義。GSTP1是體內(nèi)重要的致癌物代謝酶基因，在保護正常細胞免受促癌因素的影響以及在抑制細胞癌變中起重要作用[18]。在既往研究表明，激活HMOX1可以參與Janus激酶2/信號傳導與轉錄激活因子3的信號傳導，通過促進程序性死亡受體1及其配體的表達以及細胞之間的相互作用來削弱CD8+T淋巴細胞的細胞毒性，從而促進腫瘤細胞的增殖[19]。在很多癌癥中，細胞周期蛋白D-CDK4/6-CDK4抑制物-Rb通路的失調可以促進腫瘤細胞的增殖；而鑒于CDK4/6活性在癌細胞中的重要性，CDK4/6抑制劑已成為一種很有前途的腫瘤治療候選藥物[20]。

目前，現(xiàn)代醫(yī)學對于治療肺癌的方法僅局限于主流的化療和靶向藥物。因此，探索有效治療肺癌且天然、高效、副作用小的藥物是當今醫(yī)藥界研究的熱點。本研究初步探討了鴉膽子治療肺癌的作用機制，從分子水平分析了中醫(yī)藥治療疾病的具體作用機制，為現(xiàn)代中藥的開發(fā)提供了科學基礎。但是本研究僅基于系統(tǒng)藥理學探討了鴉膽子對肺癌治療的作用，相關研究結果還需實驗研究進一步驗證。