基于網絡藥理學熟地黃治療帕金森病的作用機制研究▲

李 鵬 劉瑛麗 駱 彤 陳 靜 吳 林

(1 山東省濟寧市中醫院腦病科，濟寧市 272100，電子郵箱：luomi0926@163.com；2山東省濟寧市第四人民醫院藥劑科，濟寧市 272100；3 廣西中醫藥大學第一臨床醫學院，南寧市 530000)

帕金森病是一種常見于中老年人的慢性退行性神經系統病變，常以運動癥狀(靜止性震顫、肌強直、運動遲緩和姿勢反射異常)和非運動癥狀(排便困難、失眠、認知功能減退、精神障礙)為臨床表現[1-2]。帕金森病的發病機制較為復雜，與黑質多巴胺能神經元退變、路易體形成、膽堿能系統功能異常、紋狀體區多巴胺遞質減少有關[3-6]。目前尚無治療特效藥，臨床多采用多巴胺受體激動劑改善癥狀,但副作用較大[7]。

熟地黃為玄參科植物地黃的根莖，經加工蒸曬而成，其味甘，性微溫，具有滋陰補腎的作用。中醫臨床常將其用于治療陰虛血少、勞嗽骨蒸、消渴、耳鳴以及男科、婦科病癥。現代藥理研究表明，熟地黃含有環烯醚萜、單萜、糖苷、糖類、氨基酸、微量元素和有機酸等多種化合物，可用于改善微循環、促進骨髓造血、抑制腫瘤因子的表達、抗感染、增強免疫等[8]。一項數據挖掘研究結果顯示，我國名中醫裘昌林擬定的用于治療帕金森病的305首方劑中，熟地黃的使用頻數共23次，僅次于天麻、鉤藤、木瓜、萸肉，其中熟地黃-萸肉藥對頻次大于50次[9]。在中醫傳承輔助平臺進行檢索，108首治療帕金森病的方劑中，使用頻次前三的中藥從高到低依次為白芍、天麻、熟地黃，熟地黃-白芍、熟地黃-天麻、熟地黃-鉤藤、熟地黃-當歸等藥對出現頻率較高[10]。熟地黃在帕金森病中應用較多，其作用機制值得深入探討。

網絡藥理學是一門綜合中藥、疾病、中藥-成分-疾病-靶點網絡的學科，能夠深入探討中藥何種有效成分作用于疾病，以及相關的生物學功能和通路[11]，為中藥研究提供了新的方法和方向[12]。因此，本研究運用網絡藥理學技術探討熟地黃治療帕金森病的作用機制，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 熟地黃有效成分的篩選 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，以“熟地黃”為關鍵詞搜索其全部活性成分。然后根據口服生物利用度(oral bioavailability,OB)>30%，藥物類藥性(drug likeness,DL)>0.18篩選有效活性成分[16]。

1.2 中藥靶點的獲取 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺中，以“熟地黃”為關鍵詞進行搜索，選擇“Related Targets”一欄，將結果導出，并通過UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)查詢其蛋白所對應的基因，并用Perl 5.26.3 軟件(https://www.perl.org/get.html)對篩選出的靶點基因進行注釋，去除重復項后獲得最終的中藥作用靶點。

1.3 疾病相關基因的獲取 分別在 GeneCards 數據庫(https://genealacart.genecards.org/)、OMIM 數據庫(https://www.omim.org/)中輸入“Parkinson′s disease”，對帕金森病相關的靶點基因進行檢索，導出結果。通過去除重復項，匯總后建立疾病基因的數據集。

1.4 中藥靶點和疾病靶點交集的獲取 所得數據導入R×64 3.6.2軟件(https://www.r-project.org/)，采用相應腳本運算，得出帕金森病相關靶點和熟地黃作用靶點的交集，即中藥-疾病靶點，并繪制韋恩圖。

1.5 中藥-有效成分-疾病-靶點調控網絡的構建 利用Perl 5.26.3軟件將熟地黃作用的靶點和中藥-疾病靶點進行一一映射，然后運用Cytoscape 3.7.2軟件(https://cytoscape.org/)對該網絡進行拓撲計算，得到中藥-成分-疾病-靶點調控網絡。

1.6 中藥-疾病靶點蛋白相互作用網絡的構建與核心基因的篩選 利用STRING 11在線軟件(https://string-db.org/)將中藥-疾病靶點輸入軟件Multiple Proteins列表下的“List of Names”中，在“Organism”中選擇“homo sapiens”，保存結果文件。將所得文件輸入 R×64 3.6.2軟件進行計算，得到蛋白互作網絡核心靶點的條圖。

1.7 中藥-疾病靶點的功能富集分析和通路富集分析 利用 R×64 3.6.2軟件進行計算，對熟地黃治療帕金森病的核心靶點進行基因本體(Gene Ontology,GO) 功能富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG) 通路富集分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 熟地黃有效成分的篩選和靶點預測結果 共搜索到熟地黃的活性成分76個，根據OB 和DL進行篩選，共獲得有效活性成分2個，包括β-谷甾醇(Mol編碼為MOL000359，OB=36.91%，DL=0.75)和豆甾醇(Mol編碼為MOL000449，OB=43.83%，DL=0.76)。 共得到中藥相關靶點327個，去除重復項后獲得中藥作用靶點26個。

2.2 中藥-疾病靶點構建的結果 獲得帕金森病相關的靶點7058個，取交集后得到中藥-疾病靶點共19個，見圖1。

圖1 中藥-疾病靶點的韋恩圖

2.3 中藥-有效成分-疾病-靶點調控網絡的構建結果 構建的調控網絡(圖2)中紅色橢圓形代表帕金森病，綠色菱形代表中藥熟地黃，黃色三角形代表熟地黃有效成分豆甾醇，紫色V形代表中藥-疾病靶點，即熟地黃主要通過豆甾醇作用于19個靶點，這19個靶點可能影響帕金森病的發生和發展。

圖2 中藥-成分-疾病-靶點調控網絡

2.4 中藥-疾病靶點蛋白相互作用網絡以及核心基因的篩選結果 中藥-疾病靶點蛋白相互作用網絡見圖3。由圖 4 可知，中藥-疾病核心基因按鄰接節點數目由多到少依次為MAOA、ADRA1B、ADRA1A、MAOB、SLC6A2、ADRA2A、ADRB2、CHRM1、SLC6A3、ADRB1、CHRM2、CHRM3、PTGS2、ADHIC、AKR1B1等。鄰接節點數目越多，成為核心基因的概率越大，故MAOA、ADRA1B、ADRA1A、MAOB、SLC6A2很有可能成為核心基因。

圖3 中藥-疾病靶點蛋白相互作用網絡

圖4 中藥-疾病核心靶點的條圖

2.5 GO功能富集分析結果 共富集到65條生物過程，熟地黃治療帕金森病的核心靶點的 GO 功能主要涉及G蛋白偶聯胺受體活性、腎上腺素能受體活性、兒茶酚胺結合、G蛋白偶聯神經遞質受體活性、神經遞質受體活性、乙酰膽堿受體活性、G蛋白偶聯、5-羥色胺受體活性等，見表1、圖5。

表1 GO富集分析部分結果

圖5 GO功能富集分析柱狀圖 (前20個)

2.6 KEGG通路富集分析結果 共富集出27條通路與熟地黃治療帕金森病有關，主要包括神經活性配體-受體相互作用通路、鈣信號通路、唾液分泌通路、脂肪細胞脂解的調節通路、心肌細胞腎上腺素能信號轉導通路、環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)-蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)信號通路、5-羥色胺能突觸通路、藥物代謝-細胞色素P450通路、組氨酸代謝通路、環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)信號通路、多巴胺能突觸通路、膽堿能突觸通路等，見表2和圖6。 鈣信號通路、 cGMP-PKG 信號通路、cAMP信號通路分別見圖7～9。

表2 KEGG 通路富集分析結果(前20個)

圖6 KEGG 通路富集分析柱狀圖

圖7 鈣信號通路

圖8 cGMP-PKG 信號通路

圖9 cAMP信號通路

3 討 論

帕金森病屬中醫“顫證”范疇,別名“顫振”“震顫”“振掉”。中醫臨床常將顫證分為肝腎陰虛型、肝風內動型、風痰阻絡型、氣血虧虛型4型[17-18]。顫證病位在腦，年老體弱是病因，而腎虛是根本[19]。熟地黃歸肝、腎經，可以滋陰補腎，適合肝腎陰虛型的帕金森病患者。

由中藥-成分-疾病-靶點調控網絡圖可知，豆甾醇是熟地黃治療帕金森病的主要有效成分。植物甾醇類具有抗神經性退化、抗氧化、抗衰老、抗動脈粥樣硬化等作用，豆甾醇屬于植物甾醇類中的一種。豆甾醇能通過大腦血流屏障,抑制氧化應激反應，提高線粒體跨膜電位和ATP量，從而減輕帕金森病患者的神經元變性[20]。

根據中藥-疾病靶點蛋白相互作用網絡和核心靶點條形圖，MAOA、ADRA1B、ADRA1A、MAOB、SLC6A2有可能是熟地黃發揮抗帕金森病作用的核心基因。MAO是人體內的能夠催化單胺類物質氧化脫氨反應的酶，包括MAOA和MAOB兩種同工酶。其中，MAOA主要分布在兒茶酚胺能神經元中，可使單胺類神經遞質(如去甲腎上腺素、5-羥色胺)失活[21]。MAOA表達上調與抑郁癥密切相關[22]，而部分帕金森病患者有不同程度的抑郁表現。MAOB主要分布在神經元(組胺能、5-羥色胺能)與神經膠質細胞中，MAOB的抑制劑有司來吉蘭、雷沙吉蘭、沙芬酰胺等[21]。MAOB的水平越高，帕金森病發病越嚴重，而MAOB抑制劑能治療早期帕金森病，延緩病情進展。ADRA1A 是腎上腺素能系統中可介導腎上腺素和去甲腎上腺素發揮生物學功能的生物傳感器[22]。ADRA1A基因和廣泛性焦慮障礙密切相關[23]，較多帕金森病患者存在焦慮障礙，而熟地黃可能通過調控ADRA1A水平改善帕金森病患者的焦慮癥狀。ADRA1B屬于G蛋白偶聯受體家族,在激活有絲分裂以及調節細胞的生長和增殖中發揮主要作用[24]，但目前尚無針對ADRA1B與帕金森病之間確切關系的研究報道，值得進一步探討。SLC6A2為去甲腎上腺素轉運體，對調控去甲腎上腺素的表達和終止神經沖動信號，保持受體對神經遞質的敏感性具有關鍵的作用[26-27]。去甲腎上腺素轉運體和多巴胺轉運體、5-羥色胺轉運體具有很高的序列同源性,而后兩者與帕金森病的發病密切相關,故作用于去甲腎上腺素轉運體很可能能改善帕金森病患者的癥狀。

GO功能分析結果，熟地黃治療帕金森病的核心基因可通過影響G蛋白偶聯胺受體活性、腎上腺素能受體活性、兒茶酚胺結合、G蛋白偶聯神經遞質受體活性、神經遞質受體活性、乙酰膽堿受體活性、G蛋白偶聯5-羥色胺受體活性等，來調控帕金森病的發生，即主要從神經遞質、乙酰膽堿、G蛋白偶聯等分子水平來治療帕金森病。本研究共富集出27條通路與治療帕金森病有關，其中包括鈣信號通路、cGMP-PKG信號通路和cAMP信號通路等。鈣離子是真核細胞中重要的第二信使[28]，對神經傳導、基因轉錄及信號通路傳導等有重要作用，鈣信號通路與帕金森病、阿爾茲海默病等神經性疾病發病密切相關[29]。研究表明，給予帕金森病小鼠注射鈣離子通道拮抗劑尼莫地平，能明顯改善小鼠的運動過緩、肌強直、靜止性震顫行為學異常[30]；高血壓病患者使用鈣離子拮抗劑治療，可明顯降低帕金森病發病風險[31]。以上研究結果均說明鈣離子拮抗劑能夠保護帕金森病，而熟地黃治療帕金森病的作用之一則是通過鈣信號通路。 GMP和NO、8-Br-c 可增加細胞內cGMP的水平，發揮抗神經元凋亡的作用[32]；而血管鈉肽通過激活cGMP/PKG信號通路，起到保護多巴胺能神經元作用[33]。但目前尚無研究表明熟地黃何種成分能促進血管鈉肽的釋放，從而激活cGMP/PKG信號通路，起到保護多巴胺能神經元。

綜上所述，熟地黃通過豆甾醇作用于帕金森病，體現了多靶點、多途徑治療帕金森病的特點，為熟地黃的臨床及實驗研究提供理論依據，為帕金森病的治療提供新方向，今后應從臨床和實驗多方面進一步驗證。