上海奉賢區奶牛結核病牛型禽型與γ-干擾素法檢測比對試驗

顧 曉 瞿 慧

1.上海市奉賢區動物疫病預防控制中心，上海201499；2.上海市奉賢區農村工作管理服務中心，上海201499

牛型、禽型皮內變態反應試驗是區分奶牛感染牛結核分枝桿菌和禽結核分枝桿菌的一種檢測方法，而γ-干擾素法檢測是以刺激培養全血為基礎，檢測牛結核病的一種試驗方法[1-2]，為了對比2 種方法在實際操作中的檢測效果，本研究對2019年下半年奉賢轄區內普檢檢測出來的3 家奶（種）牛場，共32 頭可疑奶牛進行比對試驗，比較這2 種方法在實際工作中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）牛只來源：奉賢轄區內5 家規模奶（種）牛場，經普檢判定為可疑的32 頭奶牛，所有可疑患有結核病的奶牛，均隔離消毒后待復檢。

2）材料準備：禽型提純結核菌素（荷蘭進口，2 500 IU/頭份），牛型提純結核菌素（荷蘭進口，3 000 IU/頭份），牛結核γ-干擾素ELISA 檢測試劑盒，剃刀，游標卡尺，75%酒精棉，結核菌素連續注射器，記錄紙，一次性防護用品。

1.2 操作方法

根據GB/T18645-2002 方法（國家標準動物結核病診斷技術規范）進行操作。

1.3 判定結果

1）牛型提純結核菌素反應大于禽型提純結核菌素反應，二者皮差在2 mm 以上，判為牛型提純結核菌素皮內變態反應陽性牛只，記錄符號為（+）。

2）對禽型提純結核菌素PPD 的反應大于對牛型提純結核菌素PPD 的反應，二者皮差在2 mm 以上，判為禽型提純結核菌素皮內變態反應陽性牛只，記錄符號為（+）。

1.4 γ-干擾素檢測試驗

采集奶牛尾根采血5 mL，全血置于肝素鈉抗凝管中，輕輕顛倒混勻，使肝素鈉溶解。室溫下將血樣運送實驗室，在采血后8 h 內進行刺激培養。判定結果參照BOVIGAM牛結核分枝桿菌γ-干擾素檢測試劑盒說明書進行。

1）結果判定。

①計算每個樣品陰性抗原、禽PPD 和牛PPD的平均OD 值；

②計算每頭動物所有樣品陰性抗原、禽PPD 和牛PPD 的平均OD 值；

③陽性=牛型提純結核菌素的OD－陰性抗原的OD≥0.1 且牛型提純結核菌素的OD－禽型提純結核菌素的OD≥0.1；

④陰性=牛型提純結核菌素的OD－陰性抗原的OD<0.1 或牛型提純結核菌素的OD－禽型提純結核菌素的OD<0.1。

2）警告。地塞米松治療或分娩引起的免疫抑制可降低γ-干擾素對結核桿菌抗原的應答。1 周內注射地塞米松或4 周內分娩的動物應重新檢測，以排除假陰性結果。

2 結果與分析

2019年奉賢地區奶牛結核病復檢牛結核與禽結核比對試驗情況如下：對32 頭結核病可疑奶牛進行試驗，在72 h 觀察記錄與原皮進行對比，“+”為皮差大于2 cm，作為陽性牛只。根據皮差作出判定，結果見表1。

從表2發現，感染為牛型結核病的陽性牛高達29.2%，而感染禽型結核病的陽性牛為4.2%，這表明奶牛場結核病感染較嚴重。

從表3發現，在使用牛型PPD 和禽型PPD 復檢統計出來的結果看，相符的概率比較低，只出現了3 頭結核病陽性牛只。在試驗中，使用牛型、禽型皮內變態反應試驗檢測出的陽性牛只比例高于使用γ-干擾素檢測試驗，筆者認為可能與使用皮內變態反應存在特異性差，極易造成假陽性率高有關。

3 討 論

1）從表1和表2可以看出，使用進口牛型提純結核菌素和進口禽型提純結核菌素作皮內變態反應比對試驗，結果可以看出被感染為牛型結核病牛只多于禽型結核病牛只；牛型陽性結核病牛只數占結核病可疑牛只總數的29.2%，感染禽型陽性結核病牛只數占可疑結核病牛只總數的4.2%，這說明本地區存在感染牛型和禽型結核病。因此，筆者認為應重視對禽型結核病和牛型結核病的比對試驗，減少在實際檢疫中出現的錯判、漏判等情況，提高檢疫準確率，保障養殖戶的經濟利益。

2）從表1和表2可以看出，普檢使用的哈藥集團結核菌素PPD 檢出的32 頭可疑牛只，與使用進口禽型提純結核菌素和牛型提純結核菌素做比對試驗。結果得知：使用進口禽型提純結核菌素和牛型提純結核菌素檢測奶牛結核病敏感性較強、檢測結果差異性較大。因此，說明進口禽型PPD 和牛型PPD 的非特異性大于哈藥集團PPD。

表1 32 頭奶牛72 h 牛型和禽型皮內變態反應結果

表2 2019 可疑牛只的結核復檢情況

表3 牛結核病γ-干擾素

3）從表3看出，使用牛結核病γ-干擾素試驗方法對32 頭可疑奶牛進行檢測，并與使用皮內變態反應檢測出來的7 頭陽性奶牛進行校對。結果發現，只檢測出來3 頭陽性牛只，但這3 頭陽性牛只里只有1 頭牛只與禽型結核病和牛型結核病的比對試驗檢測符合，其余2 頭在使用禽型結核病和牛型結核病的比對試驗檢測過程中無任何明顯特異性反應。

4）牛結核γ-干擾素試驗在非疫區的陽性檢出率較低。筆者認為有以下幾點原因：①感染初期或者隱性感染，機體的細胞免疫力水平高而體液免疫水平較低；②非典型分枝桿菌引發的非特異性反應或寄生蟲導致的機體細胞免疫增強。非疫區的變態反應陽性而γ-干擾素陰性的牛只，盡管有可能是非特異性感染，但也不排除是處于結核感染初期并未繼續發展，造成牛群的結核病流行。盡管γ-干擾素檢測為陰性，但采用變態反應檢測出的陽性牛只，也應把檢測出的這些牛只采取撲殺、無害化處理，在非疫區使用γ-干擾素的應用價值并不大。

5）牛結核病γ-干擾素試驗方法能夠準確、快速地排除牛結核病可疑牛只，同時能避免因使用結核菌素PPD 檢測方法所造成的誤差。但其試劑盒價格昂貴，故筆者認為應申請鼓勵政府部門加大經費的投入，確保牛結核病γ-干擾素試驗方法是作為牛結核病檢測的補充診斷方法，以避免類似于人類新冠疫情暴發的慘痛教訓。因此，提高奶牛結核病檢測的特異性和準確性是值得關注的話題，也是保障奶源安全及畜牧業穩定發展的關鍵要素。