上海奉賢區(qū)奶牛結(jié)核病牛型禽型與γ-干擾素法檢測比對(duì)試驗(yàn)

顧 曉 瞿 慧

1.上海市奉賢區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海201499；2.上海市奉賢區(qū)農(nóng)村工作管理服務(wù)中心，上海201499

牛型、禽型皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)是區(qū)分奶牛感染牛結(jié)核分枝桿菌和禽結(jié)核分枝桿菌的一種檢測方法，而γ-干擾素法檢測是以刺激培養(yǎng)全血為基礎(chǔ)，檢測牛結(jié)核病的一種試驗(yàn)方法[1-2]，為了對(duì)比2 種方法在實(shí)際操作中的檢測效果，本研究對(duì)2019年下半年奉賢轄區(qū)內(nèi)普檢檢測出來的3 家奶（種）牛場，共32 頭可疑奶牛進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)，比較這2 種方法在實(shí)際工作中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）牛只來源：奉賢轄區(qū)內(nèi)5 家規(guī)模奶（種）牛場，經(jīng)普檢判定為可疑的32 頭奶牛，所有可疑患有結(jié)核病的奶牛，均隔離消毒后待復(fù)檢。

2）材料準(zhǔn)備：禽型提純結(jié)核菌素（荷蘭進(jìn)口，2 500 IU/頭份），牛型提純結(jié)核菌素（荷蘭進(jìn)口，3 000 IU/頭份），牛結(jié)核γ-干擾素ELISA 檢測試劑盒，剃刀，游標(biāo)卡尺，75%酒精棉，結(jié)核菌素連續(xù)注射器，記錄紙，一次性防護(hù)用品。

1.2 操作方法

根據(jù)GB/T18645-2002 方法（國家標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)規(guī)范）進(jìn)行操作。

1.3 判定結(jié)果

1）牛型提純結(jié)核菌素反應(yīng)大于禽型提純結(jié)核菌素反應(yīng)，二者皮差在2 mm 以上，判為牛型提純結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)陽性牛只，記錄符號(hào)為（+）。

2）對(duì)禽型提純結(jié)核菌素PPD 的反應(yīng)大于對(duì)牛型提純結(jié)核菌素PPD 的反應(yīng)，二者皮差在2 mm 以上，判為禽型提純結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)陽性牛只，記錄符號(hào)為（+）。

1.4 γ-干擾素檢測試驗(yàn)

采集奶牛尾根采血5 mL，全血置于肝素鈉抗凝管中，輕輕顛倒混勻，使肝素鈉溶解。室溫下將血樣運(yùn)送實(shí)驗(yàn)室，在采血后8 h 內(nèi)進(jìn)行刺激培養(yǎng)。判定結(jié)果參照BOVIGAM牛結(jié)核分枝桿菌γ-干擾素檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

1）結(jié)果判定。

①計(jì)算每個(gè)樣品陰性抗原、禽PPD 和牛PPD的平均OD 值；

②計(jì)算每頭動(dòng)物所有樣品陰性抗原、禽PPD 和牛PPD 的平均OD 值；

③陽性=牛型提純結(jié)核菌素的OD－陰性抗原的OD≥0.1 且牛型提純結(jié)核菌素的OD－禽型提純結(jié)核菌素的OD≥0.1；

④陰性=牛型提純結(jié)核菌素的OD－陰性抗原的OD<0.1 或牛型提純結(jié)核菌素的OD－禽型提純結(jié)核菌素的OD<0.1。

2）警告。地塞米松治療或分娩引起的免疫抑制可降低γ-干擾素對(duì)結(jié)核桿菌抗原的應(yīng)答。1 周內(nèi)注射地塞米松或4 周內(nèi)分娩的動(dòng)物應(yīng)重新檢測，以排除假陰性結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2019年奉賢地區(qū)奶牛結(jié)核病復(fù)檢牛結(jié)核與禽結(jié)核比對(duì)試驗(yàn)情況如下：對(duì)32 頭結(jié)核病可疑奶牛進(jìn)行試驗(yàn)，在72 h 觀察記錄與原皮進(jìn)行對(duì)比，“+”為皮差大于2 cm，作為陽性牛只。根據(jù)皮差作出判定，結(jié)果見表1。

從表2發(fā)現(xiàn)，感染為牛型結(jié)核病的陽性牛高達(dá)29.2%，而感染禽型結(jié)核病的陽性牛為4.2%，這表明奶牛場結(jié)核病感染較嚴(yán)重。

從表3發(fā)現(xiàn)，在使用牛型PPD 和禽型PPD 復(fù)檢統(tǒng)計(jì)出來的結(jié)果看，相符的概率比較低，只出現(xiàn)了3 頭結(jié)核病陽性牛只。在試驗(yàn)中，使用牛型、禽型皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢測出的陽性牛只比例高于使用γ-干擾素檢測試驗(yàn)，筆者認(rèn)為可能與使用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)存在特異性差，極易造成假陽性率高有關(guān)。

3 討 論

1）從表1和表2可以看出，使用進(jìn)口牛型提純結(jié)核菌素和進(jìn)口禽型提純結(jié)核菌素作皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)比對(duì)試驗(yàn)，結(jié)果可以看出被感染為牛型結(jié)核病牛只多于禽型結(jié)核病牛只；牛型陽性結(jié)核病牛只數(shù)占結(jié)核病可疑牛只總數(shù)的29.2%，感染禽型陽性結(jié)核病牛只數(shù)占可疑結(jié)核病牛只總數(shù)的4.2%，這說明本地區(qū)存在感染牛型和禽型結(jié)核病。因此，筆者認(rèn)為應(yīng)重視對(duì)禽型結(jié)核病和牛型結(jié)核病的比對(duì)試驗(yàn)，減少在實(shí)際檢疫中出現(xiàn)的錯(cuò)判、漏判等情況，提高檢疫準(zhǔn)確率，保障養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)利益。

2）從表1和表2可以看出，普檢使用的哈藥集團(tuán)結(jié)核菌素PPD 檢出的32 頭可疑牛只，與使用進(jìn)口禽型提純結(jié)核菌素和牛型提純結(jié)核菌素做比對(duì)試驗(yàn)。結(jié)果得知：使用進(jìn)口禽型提純結(jié)核菌素和牛型提純結(jié)核菌素檢測奶牛結(jié)核病敏感性較強(qiáng)、檢測結(jié)果差異性較大。因此，說明進(jìn)口禽型PPD 和牛型PPD 的非特異性大于哈藥集團(tuán)PPD。

表1 32 頭奶牛72 h 牛型和禽型皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)結(jié)果

表2 2019 可疑牛只的結(jié)核復(fù)檢情況

表3 牛結(jié)核病γ-干擾素

3）從表3看出，使用牛結(jié)核病γ-干擾素試驗(yàn)方法對(duì)32 頭可疑奶牛進(jìn)行檢測，并與使用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測出來的7 頭陽性奶牛進(jìn)行校對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只檢測出來3 頭陽性牛只，但這3 頭陽性牛只里只有1 頭牛只與禽型結(jié)核病和牛型結(jié)核病的比對(duì)試驗(yàn)檢測符合，其余2 頭在使用禽型結(jié)核病和牛型結(jié)核病的比對(duì)試驗(yàn)檢測過程中無任何明顯特異性反應(yīng)。

4）牛結(jié)核γ-干擾素試驗(yàn)在非疫區(qū)的陽性檢出率較低。筆者認(rèn)為有以下幾點(diǎn)原因：①感染初期或者隱性感染，機(jī)體的細(xì)胞免疫力水平高而體液免疫水平較低；②非典型分枝桿菌引發(fā)的非特異性反應(yīng)或寄生蟲導(dǎo)致的機(jī)體細(xì)胞免疫增強(qiáng)。非疫區(qū)的變態(tài)反應(yīng)陽性而γ-干擾素陰性的牛只，盡管有可能是非特異性感染，但也不排除是處于結(jié)核感染初期并未繼續(xù)發(fā)展，造成牛群的結(jié)核病流行。盡管γ-干擾素檢測為陰性，但采用變態(tài)反應(yīng)檢測出的陽性牛只，也應(yīng)把檢測出的這些牛只采取撲殺、無害化處理，在非疫區(qū)使用γ-干擾素的應(yīng)用價(jià)值并不大。

5）牛結(jié)核病γ-干擾素試驗(yàn)方法能夠準(zhǔn)確、快速地排除牛結(jié)核病可疑牛只，同時(shí)能避免因使用結(jié)核菌素PPD 檢測方法所造成的誤差。但其試劑盒價(jià)格昂貴，故筆者認(rèn)為應(yīng)申請(qǐng)鼓勵(lì)政府部門加大經(jīng)費(fèi)的投入，確保牛結(jié)核病γ-干擾素試驗(yàn)方法是作為牛結(jié)核病檢測的補(bǔ)充診斷方法，以避免類似于人類新冠疫情暴發(fā)的慘痛教訓(xùn)。因此，提高奶牛結(jié)核病檢測的特異性和準(zhǔn)確性是值得關(guān)注的話題，也是保障奶源安全及畜牧業(yè)穩(wěn)定發(fā)展的關(guān)鍵要素。