金針菇黑腐病病原菌的分離與分子鑒定*

蘭玉菲，張煥利，于清偉，叢倩倩

（泰安市農業科學研究院，山東 泰安 271000）

金針菇[Flammulina velutipes（Fr.）Singer]，是一種在世界上廣泛栽培的重要食用菌之一，營養豐富、味道鮮美，深受人們喜愛[1-2]。

近幾年，山東省工廠化金針菇發展迅速，主要栽培種類為白色金針菇。隨著栽培規模的不斷擴大和栽培年限的延長，病害發生越發嚴重，黑腐病是金針菇工廠化生產中的主要病害之一，給工廠化金針菇生產帶了嚴重損失。為明確黑腐病病原菌，對病原菌進行分離和分子鑒定，明確了病原菌的分類地位，為科學防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

1.2 培養基

NA 培養基：蛋白胨 10 g·L-1、牛肉膏 3 g·L-1、NaCl 5 g·L-1、瓊脂 20 g·L-1。

LB培養基：胰蛋白胨10 g·L-1、酵母提取物5 g·L-1、NaCl 10 g·L-1。

1.3 病原菌分離和純化

分別取菌蓋和菌柄病健交界處組織進行病原菌的分離、純化，方法參照文獻[3]。

1.4 致病性測定

將純化的菌株在NA平板上28℃培養48 h后，用無菌水配成細菌懸浮液（約1×108cfu·mL-1）。采用噴霧法接種，分別將2 mL細菌懸浮液噴灑在正常生長的金針菇菌蓋和菌柄處，無菌水處理為對照，接種后的金針菇置于15℃菇房內，保持空氣相對濕度90%，每天觀察發病情況。從接種發病的金針菇菌蓋和菌柄上重新分離病原菌并鑒定。

1.5 病原菌的分子鑒定

1.5.1 基因組DNA提取

將分離純化的菌株在NA培養基上劃線，挑取單菌落于LB培養基中，28℃震蕩培養過夜，收集菌體，利用Solarbio細菌基因組DNA提取試劑盒提取致病菌基因組DNA。

1.5.2 16S rDNA和gyrB序列的擴增

以DNA為模板，使用高保真酶，利用引物分別擴增致病菌的16S rDNA和gyrB序列，引物名稱及序列見表1。

從整體上來看，我國生態旅游發展已漸入快車道，發展規模不斷擴大，發展態勢逐漸強勁。然而，相較于國外生態旅游的發展狀態，仍面臨著發展單一、發展不平衡等很多發展中的問題。中俄界江生態旅游發展受制于政治經濟文化等各方面的因素，尚處于發展的初始時期，面臨著開發粗放化、產品同質化和生態意識薄弱化等問題。

表1 引物名稱及序列Tab.1 Primer names and sequences

1） PCR反應體系

5×buffer 10 μL、dNTP （2.5 mmol·L-1each）4 μL、上游引物（10 μmol·L-1）1.5 μL、下游引物（10 μmol·L-1）1.5 μL、酶（2.5 U·μL-1）0.5 μL、模板 1 μL、ddH2O 補加至 50 μL。

2） 擴增16S rDNA基因的反應程序

94℃預變性3 min；98℃變性10 s；55℃退火5 s；72℃延伸100 s，共進行35個循環；最后72℃，延伸5 min。

3）擴增gyrB基因的反應程序

94℃預變性3 min；94℃變性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸1 min，共進行35個循環；最后72℃，延伸10 min。

PCR擴增結束后，電泳并切膠回收目的產物送山東省農業科學院測序中心測序。

1.5.3 序列比對及系統進化樹構建

將所得DNA序列輸入GenBank進行Blast檢索，采用DNASTAR、DNAMAN和MEGA 6等軟件對所得的核苷酸序列與GenBank中收錄分離物的相應序列進行比較和分析，構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

工廠化金針菇自然發病癥狀見圖1A、圖1B，致病性試驗接種菌蓋和菌柄后發病癥狀見圖1C、圖1D。

如圖1A、圖1B所示，該病害一般從菌柄基部（瓶口周圍）發病，初期呈黃褐色至黑褐色，并可延菌柄往上侵染幼小菇蕾，導致其萎蔫死亡；亦可直接侵染菌蓋，呈現凹陷病斑，初期黃色，后期顏色逐漸加深，最后萎焉死亡。

2.2 致病性測定

分別從菌蓋和菌柄分離獲得20個菌落形態一致的單菌落進行致病性測定，其中16個菌落接種后，3天后菌蓋和菌柄出現明顯的黑褐色病斑和腐爛癥狀，癥狀與工廠化金針菇自然發病癥狀相同（圖1C和圖1D），而噴灑無菌水的對照子實體生長正常。說明分離的16個單菌落均為金針菇黑腐病的致病菌。其余4個單菌落接種后未出現癥狀，通過初步接種鑒定為非致病菌。

2.3 病原菌的序列測定與分析

利用Solarbio細菌基因組DNA提取試劑盒提取致病菌基因組DNA。以DNA為模板，使用高保真酶，利用表1的引物分別擴增3個致病菌的16S rDNA和gyrB基因。PCR擴增結束后，電泳并切膠回收目的產物送測序公司測序。分別得到長度約為1 400 bp的16S rDNA基因和900 bp的gyrB基因。分別基于ITS和gyrB基因序列構建的NJ系統發育樹見圖2和圖3。

從圖2和圖3可知，同源性比對結果表明分離的3個致病菌的16S rDNA基因與GenBank中托拉斯假單胞桿菌（Pseudomonas tolaasii）的分離物的同源性最高，核苷酸一致率最高為100%；gyrB基因與GenBank中Pseudomonas tolaasii分離物（AB039423）同源性最高，核苷酸一致率為100%。進一步基于ITS和gyrB 2個基因序列構建系統進化樹，結果表明，引起金針菇黑腐病的致病菌與GenBank中托拉斯假單胞桿菌（Pseudomonas tolaasii）的分離物聚為一簇，組內核苷酸一致率均高達100%，因此分子鑒定病原菌為P.tolaasii。

3 討論

通過致病性試驗篩選出引起金針菇黑腐病的病原菌，進一步擴增病原菌的ITS和gyrB 2個基因并構建系統進化樹，結果表明引起金針菇黑腐病的病原菌與GenBank中托拉斯假單胞桿菌（P.tolaasii）的分離物聚為一簇，組內核苷酸一致率均高達100%，因此確定病原菌為P.tolaasii。前人研究結果表明托拉斯假單胞桿菌（P.tolaasii）可以危害平菇（Pleurotus ostreatus）、金針菇、雙孢菇（Agaricus bisporus）、杏鮑菇（Pleurotus eryngi）、香菇（Lentinula edodes） 等多種食用菌并造成巨大的經濟損失[4-6]。本研究在國內外已有研究基礎上，基于ITS和gyrB 2個基因對工廠化金針菇黑腐病病原進行了分子鑒定，明確其病原為P.tolaasii，為該病害的防治和抗病品種的選育研究奠定理論基礎。