煙色離褶傘液體菌種培養條件優化及工廠化栽培研究*

劉 娜，張 敏，張士義，李宏亮，宋 瑩

（遼寧省農業科學院食用菌研究所遼寧省食用菌優質栽培重點實驗室，遼寧 沈陽 110161）

煙色離褶傘（Lyophyllum fumosumy），系傘菌目（Agaricales） 離褶傘科 （Lyophyllaceae） 離褶傘屬（Lyophyllum）真菌[1]。煙色離褶傘在遼寧地區享譽盛名，風味獨特，被當地百姓視為珍品[2]。近年來，由于生境變化和人類活動等的影響，野生煙色離褶傘已瀕臨滅絕，而煙色離褶傘的普通溫室人工栽培周期長，栽培難度很大。目前，人工培育煙色離褶傘的難題是制種和催蕾，其育種期約90 d，催蕾期對光照、溫度、濕度等要求嚴格。目前，煙色離褶傘在日光溫室內以秸稈、稻草為主料進行菌袋碼堆墻式出菇，工序繁瑣，環境條件無法精確控制，生物學效率僅為55%左右[3]。而工廠化栽培煙色離褶傘比自然條件或輔助設施栽培更能夠準確控制溫度、濕度、光線、二氧化碳濃度等環境條件[4]。因此，利用液體菌種為原種，用于工廠化栽培出菇，可使菌種生產周期大幅度縮短。在優化液體菌種培養條件的同時，開展了煙色離褶傘工廠化栽培技術初探，以期為煙色離褶傘工廠化開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

煙色離褶傘菌株，由遼寧省農業科學院食用菌研究所遺傳育種研究室提供。原種采自彰武縣四合城鄉，純化后經中國科學院微生物研究所鑒定命名為煙色離褶傘。

1.1.2 液體菌種基礎培養基配方

馬鈴薯20%、葡萄糖2%，蛋白胨0.20%、磷酸二氫鉀0.30%、硫酸鎂0.15%，自來水定容至1 000 mL。

1.2 液體菌種培養條件優化單因素試驗

設計碳源、氮源、外源營養、培養溫度4個液體菌種培養條件的單因素試驗。除溫度試驗外，其余試驗均在25℃條件下培養（250 mL三角瓶培養液的裝液量為100 mL，用6 mm打孔器取菌種2塊接入液體培養基），培養8 d時，通過測量菌絲生物量、菌球密度及菌球直徑確定最佳單因素培養條件[5]。

1.2.1 碳源

在每升基礎培養基中分別加入2.0%的木糖、果糖、海藻糖、蜜糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、山梨醇替代葡萄糖，包括基礎培養基共配成10種碳源培養基。

1.2.2 氮源

在每升基礎培養基中分別加入0.2%的酪蛋白氨基酸、尿素、酵母膏、氯化銨、牛肉膏、黃豆粉替代蛋白胨，包括基礎培養基共配成7種氮源培養基。

1.2.3 外源營養

在每升培養基中分別加入0.6 g復合維生素B（維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、泛酸、煙酸）、0.5%的草炭土、玉米秸稈、玉米芯及草炭加麥麩（3∶1）、玉米秸稈加麥麩（3∶1）、玉米芯加麥麩（3∶1）提取液，共7種外源營養培養基。

1.2.4 培養溫度

將液體菌種分別放入23℃、25℃、28℃搖床，轉速均為 150 r·min-1。

1.3 液體菌種培養條件優化的正交試驗

根據單因素試驗結果，確定最佳搖瓶培養條件的碳源、氮源和外源營養，設計L9（33）正交試驗，每組試驗設3個重復[7]，通過測定菌絲生物量確定最佳煙色離褶傘液體菌種最佳培養配方。試驗因素及水平見表1。

表1 試驗因素及水平Tab.1Factors and levels of L9（33）orthogonal test

1.4 工廠化栽培研究選擇

1.4.1 各條件選擇

1） 培養基配方

菌絲培養期間溫度為25℃，黑暗培養；出菇階段溫度為16℃～18℃，濕度90%～97%。設置3個工廠化栽培培養基配方，分別為：配方1（草炭78%、麥麩20%、石膏1%和石灰1%）；配方2（草炭28%、玉米芯25%、玉米秸稈25%、麥麩20%、石膏1%和石灰1%）；配方3（菌糠40%、秸稈38%、麥麩20%、石膏1%和石灰1%）。采用850 mL聚丙烯瓶，覆土栽培，每個配方生產100瓶。

2）人工栽培容器選擇

選用500 mL罐頭瓶（培養基裝1/2、裝滿瓶）、850 mL細口聚丙烯瓶、30 cm×30 cm×15 cm聚丙烯盆、耐高溫廣口丙烯組培瓶2組（高14.0 cm，口徑11.4 cm，底面直徑 10.0 cm；高 8.5 cm，口徑 9.5 cm，底面直徑8.3 cm）進行覆土栽培（草炭土厚度0.5 cm）。

3） 覆土與未覆土

采用細口聚丙烯瓶栽，搔菌后進行覆土與未覆土2種處理方式，草炭土覆土厚度為0.5 cm。

1.4.2 檢測數據

觀察各菌株子實體的形態特征，不同栽培條件重復隨機選取10個子實體，測量菌蓋直徑、菌蓋厚度及菌柄長度、菌柄直徑，取其平均值。用DPS數據處理系統對試驗結果進行方差分析。生物學效率（BE，%）的計算公式為：

BE=Ffw/Sdw×100%

式中：Ffw表示子實體鮮重（g）；Sdw表示培養料干重 （g）。

1.4.3 人工栽培和野生煙色離褶傘營養成分測定

委托中國科學院沈陽生態所農產品安全與環境質量檢測中心檢測其干品18種氨基酸、粗多糖、蛋白質等含量。

2 結果與分析

2.1 液體菌種單因素試驗結果

2.1.1 碳源對煙色離褶傘菌絲生長的影響

不同碳源對煙色離褶傘菌液體菌種菌絲生長情況的影響見表2。

表2 不同碳源液體菌種菌絲生長情況Tab.2 Effects of different carbon source on mycelial growth

由表2可知，綜合比較，2%麥芽糖菌球密度最大，菌絲生物量最重，菌球直徑相對較小、整齊，因此煙色離褶傘液體培養的最適碳源為麥芽糖。

2.1.2 氮源對煙色離褶傘菌絲生長的影響

不同氮源對煙色離褶傘菌液體菌種菌絲生長情況的影響見表3。

表3 不同氮源液體菌種菌絲生長情況Tab.3 Effects of different nitrogen source on mycelial growth

由表3可知，尿素抑制菌球生長。綜合比較，0.2%黃豆粉菌球密度最大，菌球直徑最小、整齊，菌絲生物量相對較重，因此煙色離褶傘液體培養的最適氮源為黃豆粉。

2.1.3 外源營養物對煙色離褶傘菌絲生長的影響

不同外源營養物對煙色離褶傘菌液體菌種菌絲生長情況的影響見表4。由表4可知，綜合比較，0.6 g·L-1復合維生素B菌球密度最大，菌球直徑最小、整齊，菌絲生物量相對較重，因此煙色離褶傘液體培養的最適外源營養物為復合維生素B。

2.1.4 溫度對煙色離褶傘菌絲生長的影響

不同溫度對煙色離褶傘菌液體菌種菌絲生長情況的影響見表5。由表5可知，綜合比較，23℃菌球密度最大，菌球直徑最小、整齊，菌絲生物量相對較重，因此煙色離褶傘液體培養的最適溫度為23℃。

2.2 液體菌種正交試驗結果

最佳培養條件液體菌種正交試驗結果見表6，液體菌種生長情況見圖1。由表6、圖1可知，正交試驗結果驗證確定煙色離褶傘菌種培養最佳組合為A3B2C2，即碳源麥芽糖2.5%，氮源黃豆粉0.2%，外源營養復合維生素B 0.6 g·L-1，而且液體菌種菌球顆粒小、密度大。

表4 不同外源營養物對液體菌種菌絲生長情況Tab.4 Effects of different exogenous compound on mycelial growth

表5 不同溫度液體菌種菌絲生長情況Tab.5 Effects of different temperature on mycelial growth

2.3 工廠化栽培研究結果

2.3.1 培養基配方試驗結果

工廠化栽培不同配方對煙色離褶傘農藝性狀的影響見表7。由表7可知，煙色離褶傘菌絲在3種培養料中均可生長和出菇。配方3從接種到出菇所用時間最短，為68 d～72 d，配方2最慢，但配方2的生物學效率明顯高于配方1和配方3，達68%；子實體顏色均為灰色，3個配方菌蓋大小及厚度差異不明顯，配方1菌柄明顯短于其他2個配方。

2.3.2 不同栽培方式試驗結果

不同栽培方式對煙色離褶傘農藝性狀的影響見表8。由表8可知，6種栽培方式均能出菇，菌齡與培養料多少有關，采用耐高溫聚丙烯組培瓶栽培（小），子實體菌蓋明顯小于其他5種栽培方式，菌柄長于其他3種栽培方式。生物學效率差異明顯，生物學效率大小依次為細口聚丙烯瓶栽＞盆栽＞耐高溫廣口聚丙烯組培瓶（大） ＞罐頭瓶（滿） ＞聚丙烯廣口組培瓶（小）＞罐頭瓶（1/2）。細口聚丙烯瓶由于瓶口小，養分供應比較集中，氧氣含量較低，保濕性好，菇蕾發生整齊，菇柄長，子實體生長整齊，產量明顯高于其他幾種出菇方式。

2.3.3 覆土試驗結果

覆土栽培與未覆土栽培對煙色離褶傘農藝性狀的影響見表9。由表9可知，未覆土煙色離褶傘菌株比覆土栽培生育期短約5 d，子實體農藝性狀指標小于覆土栽培，栽培生物學效率為66%，覆土后生物學效率達68%，生物學效率差異不明顯，從節約成本角度考慮工廠化栽培可以不覆土處理。

2.3.4 人工栽培和野生煙色離褶傘營養成分檢測

煙色離褶傘營養成分分析結果見表10。由表10可知，野生煙色離褶傘子實體中蛋白質含量為32.200 0%，粗多糖含量為6.450 0%，18種氨基酸總量為20.270 7 g·100-1g-1；栽培煙色離褶傘蛋白質含量為32.000 0%，粗多糖含量為3.020 0%，18種氨基酸含量19.393 0 g·100-1g-1。人體必需氨基酸含量中，人工栽培的煙色離褶傘含量為8.014 6 g·100-1g-1，比野生含量（6.530 8 g·100-1g-1）高1.483 8 g·100-1g-1。

3 結論

煙色離褶傘菌種最佳營養條件為碳源麥芽糖2.5%，氮源黃豆粉0.2%，外源營養復合維生素B 0.6 g·L-1。采用此配方，搖床培養溫度為23℃的條件下菌球顆粒小、密度大，菌絲生物量最高；工廠化栽培培養基配方草炭28%、玉米芯25%、玉米秸稈25%、麥麩20%、石膏1%、石灰1%，子實體產量最高為68%；煙色離褶傘工廠化栽培宜選用聚丙烯瓶；試驗菌株采用覆土方式生物學效率略高于未覆土，但將增加人工成本，因此可不進行覆土處理；野生煙色離褶傘和人工栽培的干品子實體中蛋白質含量近似，野生煙色離褶傘中氨基酸總量和粗多糖總含量均高于人工栽培的煙色離褶傘，但在人體必需氨基酸含量中，人工栽培比野生的煙色離褶傘高1.483 8 g·100-1g-1。

表7 不同配方對煙色離褶傘農藝性狀的影響Tab.7 Effects of different formulas on agronomic traits of Lyophyllum fumosum

表8 不同栽培方式煙色離褶傘農藝性狀的影響Tab.8 Effects of different cultivation method on agronomic traits of Lyophyllum fumosum

表9 覆土與未覆土對煙色離褶傘農藝性狀的影響Tab.9 Effect of covering soil on agronomic traits of Lyophyllum fumosum

表10 煙色離褶傘營養成分分析Tab.10 Nutritional components analysis of cultivated and wild Lyophyllum fumosum

煙色離褶傘氨基酸總量明顯高于金針菇13.686 g·100-1g-1～16.096 g·100-1g-1[8]，蛋白質含量遠遠高于白玉菇 17.56 g·100-1g-1[9]、真姬菇 22.30 g·100-1g-1[10]、杏鮑菇20.00 g·100-1g-1[11]。煙色離褶傘是一種高蛋白、低脂肪營養價值極高的食用菌新品種，但對其成分分析卻較少，許多潛在價值尚未得到開發利用[12]。因此，今后應加強對煙色離褶傘子實體深加工及產物成分和主要功能的研究，為煙色離褶傘市場開發奠定基礎。