北京靈山野生桑黃的分離鑒定與生物學(xué)特性*

韓 鵬，孔繁帝，陳青君，張國慶，**

（1.北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院 北京農(nóng)學(xué)院林木分子設(shè)計育種高精尖創(chuàng)新中心農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

桑黃，俗稱桑耳、桑臣、猢猻眼等，是我國著名藥用真菌，藥用歷史超過2 000年，早在秦漢時期《神農(nóng)本草經(jīng)》中已有記載[1]。中醫(yī)認(rèn)為，桑黃“性甘、平，味苦、辛，歸肝、膀胱經(jīng)”，可用于治療血崩、脫肛瀉血、脾虛泄瀉等病癥[2-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，桑黃真菌富含多糖、黃酮和三萜等活性成分，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、護(hù)肝保肝、抗氧化、抑菌消炎等作用[1，4]。分類學(xué)認(rèn)為，桑黃類真菌由擔(dān)子菌門 （Basidiomycota） 傘菌綱 （Agaricomycetes）銹革孔菌目（Hymenochaetales） 銹革孔菌科（Hymenochaetaceae）中多個屬真菌組成，包括纖孔菌屬（Inonotus）、擬層孔菌屬（Fomitopsis）、嗜藍(lán)孢孔菌屬（Fomitiporia）、木層孔菌屬 (Phellinus)、桑黃屬（Sanghuangporus） 等[5-6]。

鮑姆纖孔菌（Inonotus baumii）是桑黃類真菌中最常見一種藥用菌，其多發(fā)生于丁香屬（Syringa）植物上，尤其是暴馬丁香（S.amurensis），少數(shù)生長于白蠟樹屬（Fraxinus）、李屬（Prunus） 等植物枝干上[7]。其子實(shí)體單生，無柄，新鮮時為硬木拴質(zhì)，干燥后質(zhì)量變輕呈木質(zhì)，初期為黃褐色后期隨菌齡的增長顏色逐漸變?yōu)槔鹾稚梁诤稚玔8]。鮑姆纖孔菌作為桑黃類真菌的主要類群，其藥用活性被廣泛報道，包括抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、保肝、DNA損傷保護(hù)等。Zhang等[9]報道，固態(tài)發(fā)酵的鮑姆纖孔菌菌絲具有抑制白血病細(xì)胞系K562和L1210等腫瘤細(xì)胞增殖的作用。Jin等[10]報道，鮑姆纖孔菌子實(shí)體多糖具有抗氧化和DNA損傷保護(hù)功能。Sung等[11]發(fā)現(xiàn)，分離自鮑姆纖孔菌的β-葡聚糖具有激活NADPH氧化酶（NOC），能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用和氮氧化物活性。Zhang等[12]從人工栽培的鮑姆纖孔菌子實(shí)體中分離獲得多糖PPB-2，發(fā)現(xiàn)其具有降血糖和肝保護(hù)作用。

北京小龍門森林公園位于北京市門頭溝區(qū)（北緯 39°58′，東經(jīng) 115°26′），小龍門森林公園屬小五臺山脈，園內(nèi)平均海拔1 150 m，年降水量為500 mm～600 mm，園內(nèi)生物資源豐富，種類繁多[13]。郝德旺等[14]報道，園內(nèi)共采集并鑒定出47種真菌，隸屬于子囊菌門2目、2科、3種和擔(dān)子菌門5目、18科、44種。通過以采集自小龍門森林公園的野生桑黃子實(shí)體為材料，分離獲得純培養(yǎng)菌株，進(jìn)一步開展分類學(xué)鑒定、最適培養(yǎng)條件研究，旨在為我國野生藥用真菌資源保護(hù)與利用奠定理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生桑黃子實(shí)體樣品采集自小龍門森林公園，純培養(yǎng)菌株由北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院分離、鑒定和保藏，菌株編號為F1637。

1.2 培養(yǎng)基

菌株分離與保藏使用土豆葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，液體發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)利用土豆葡萄糖（PD）培養(yǎng)基，菌絲體最適培養(yǎng)條件試驗(yàn)采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基（葡萄糖20 g、大豆蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀1 g、瓊脂 20 g，硫酸鎂 0.5 g、維生素 B110.0 mg，pH 7.0～7.2，蒸餾水1 000 mL） 和加富培養(yǎng)基（葡萄糖20 g、大豆蛋白胨2 g、馬鈴薯200 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀 1 g，硫酸鎂 0.5 g、維生素 B1 10.0 mg，蒸餾水 1 000 mL）[15]。

1.3 菌株分離、培養(yǎng)與保存

菌株純培養(yǎng)分離以子實(shí)體為材料，采用組織分離法，28℃ 培養(yǎng)，4℃ 保存[16]。

1.4 形態(tài)鑒定

觀察子實(shí)體形態(tài)特征并記錄。采用插片法進(jìn)行菌絲體形態(tài)觀察，在無菌條件下，將直徑為5 mm的純培養(yǎng)F1637菌絲接種于PDA平板中央，在距離接種點(diǎn)1.5 cm左右的培養(yǎng)基上，以30°～45°斜插入無菌的蓋玻片，28℃避光培養(yǎng)。待菌絲體生長蔓上載玻片后，取出載玻片進(jìn)行菌絲體顯微觀察并拍照[16]。

1.5 分子鑒定

分別采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和核糖體大亞基基因（LSU-rDNA） 鑒定，引物序列見表1。F1637菌株的菌絲體總DNA提取使用新型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）。PCR產(chǎn)物測序，利用BLAST在線比對（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）分析，利用MEGA 7.0軟件、以Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析同源關(guān)系。

1.6 菌絲體最適培養(yǎng)條件

開展F1637菌株菌絲體最適培養(yǎng)條件研究，依次進(jìn)行最適碳源、最適氮源、最適碳氮比、最適生長因子、最適溫度和最適pH試驗(yàn)，每個試驗(yàn)組設(shè)3個平行。以直徑5 mm的新鮮菌餅接種于各試驗(yàn)組平板中央，除最適溫度試驗(yàn)外，各平板于28℃避光培養(yǎng)，待任意處理長至平板3/4或培養(yǎng)14 d后停止培養(yǎng)，觀察并記錄菌落特征，測量菌落直徑，計算菌絲體日均生長速率。菌絲生長速率（V，mm·d-1）的計算公式為[15]：

式中：S為菌落半徑（mm）；D為菌絲生長天數(shù)（d）。

1.7 發(fā)酵培養(yǎng)與發(fā)酵液收集

液體發(fā)酵采用PD培養(yǎng)基，500 mL錐形瓶裝液150 mL，接種5個直徑為5 mm菌餅、28℃、150 r·min-1培養(yǎng)20 d，以8層紗布過濾菌絲體，收集濾液，4℃、12 000 r·min-1離心5 min，收集上清液備用。

1.8 發(fā)酵液中多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定發(fā)酵液中總糖含量[19-20]，采用3，5-二硝基水楊酸法測定發(fā)酵液中還原糖含量[21-22]。發(fā)酵液中多糖含量（mp，g·L-1）計算公式為[23]：

式中：mp、mc和mr分別每升發(fā)酵液中多糖、總糖和還原糖的含量（g·L-1）。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)鑒定

F1637菌株子實(shí)體、菌落及菌絲體形態(tài)見圖1。

如圖1A所示，菌株子實(shí)體蹄型，無柄，堅(jiān)硬木栓質(zhì)，長3.5 cm，寬2.8 cm；菌蓋呈黑灰色，有放射狀開裂。純培養(yǎng)菌落形態(tài)如圖1B所示，菌絲初期為白色絨毛狀，后逐漸變?yōu)闇\黃至黃褐色，邊緣為白色細(xì)微菌絲；菌絲在PDA平板上生長較緩慢，28℃培養(yǎng)4 d～6 d直徑約3 cm左右，14 d長滿平板。F1637菌株菌絲顯微形態(tài)如圖1C所示，菌絲有分枝和分隔，無鎖狀聯(lián)合。

2.2 分子鑒定

經(jīng)PCR擴(kuò)增和測序，獲得F1637菌株ITS以及LSU-rDNA序列片段，長度分別為752 bp和619 bp，利用BLAST在線比對，以纖孔菌屬相近種，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2、圖3。

由圖2、圖3系統(tǒng)發(fā)育分析表明，F(xiàn)1637菌株與鮑姆纖孔菌（I.baumii）相似性最高，為98%；ITS遺傳距離為 0.017 0，LSU-rDNA 遺傳距離為 0.004 0，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定該菌株為鮑姆纖孔菌。

2.3 最適碳源

不同碳源對F1637菌株菌絲體生長的影響見表2。

由表2所示，F(xiàn)1637菌株在不同碳源培養(yǎng)基上均能生長，生長速率由快到慢依次為：山梨醇＞葡萄糖≈甘露醇≈蔗糖＞淀粉＞麥芽糖≈對照＞乳糖≈羧甲基纖維素鈉。菌絲在以山梨醇為碳源的培養(yǎng)基上生長最佳，菌落淺黃色、產(chǎn)生褐色色素，中央菌絲（接種點(diǎn)附近）白色、外周淺黃色；其次為葡萄糖及甘露醇培養(yǎng)基，葡萄糖培養(yǎng)基上菌落黃色、產(chǎn)生褐色色素，中央菌絲黃色、外圍菌絲淺黃色，甘露醇培養(yǎng)基上菌落黃色；在以蔗糖、淀粉、麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中，菌絲生長速率較慢且菌絲稀疏；在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基中菌絲長速慢但較濃密；以羧甲基纖維素鈉為碳源的培養(yǎng)基中，菌絲生長慢且稀松；而在空白對照培養(yǎng)中，菌絲稀疏。綜合菌絲長勢和生長速率，該菌株最適碳源為山梨醇，其次為葡萄糖或甘露醇。

表2 碳源對F1637菌株菌絲體生長的影響Tab.2 Effect of the carbon sources on mycelial growth of strain F1637

2.4 最適氮源

不同氮源對菌株F1637菌絲體生長的影響見表3。

表3 氮源對F1637菌株菌絲體生長的影響Tab.3 Effect of the nitrogen sources on mycelial growth of stain F1637

由表3可知，在空白對照組、玉米粉和黃豆粉氮源培養(yǎng)基上，F(xiàn)1637菌株均無法生長；其他培養(yǎng)基菌株F1637菌絲均能生長，生長速率由快到慢依次為：酵母浸粉＞胰蛋白胨＞牛肉浸膏＞硫酸銨＞尿素≈硝酸銨＞甘氨酸。在不同氮源培養(yǎng)基上，菌落顏色表現(xiàn)出由淺黃到黃褐色的不同顏色，并產(chǎn)生淺褐至深褐色色素。菌株在以酵母浸粉為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長最佳，菌絲生長速率快且濃密，產(chǎn)生淺褐色色素；其次為胰蛋白胨，菌絲形態(tài)與酵母浸粉相比略稀松；空白對照組、玉米粉、黃豆粉培養(yǎng)基在接種點(diǎn)處產(chǎn)生褐色色素，但無顯著菌絲生長。結(jié)合菌絲生長速率與長勢，該菌株的最適氮源為酵母浸粉。

2.5 最適碳氮比

碳氮比對菌株菌絲生長的影響見圖4。

由圖4可知，F(xiàn)1637菌株在碳氮比在10∶1～60∶1條件下下均能生長，生長速率由快到慢依次為：50∶1＞60∶1＞30∶1＞40∶1＞20∶1＞10∶1。F1637菌株在各碳氮比條件下均產(chǎn)生褐色色素，菌絲在10∶1培養(yǎng)基上呈淡黃色，隨著碳氮比的增加顏色逐漸加深，碳氮比50∶1和60∶1時為灰褐色。菌株在碳氮比為50∶1時的培養(yǎng)基中生長最快，但菌絲略呈絨毛狀且較為稀疏，有褐色色圈產(chǎn)生；菌株在碳氮比為60∶1的培養(yǎng)基上生長稍慢于50∶1，但菌絲生長較為致密且長勢旺盛，為淡黃色。綜合菌絲長勢和長速，該菌株的最適碳氮比為60∶1。

2.6 最適生長因子

不同生長因子對F1637菌株菌絲體生長影響見表4。

表4 生長因子對F1637菌株菌絲體生長的影響Tab.4 Effect of growth factor on mycelial growth of strain F1637

由表4可知，F(xiàn)1637菌株在不同生長因子培養(yǎng)基上均能生長，且均產(chǎn)生淺褐色至褐色色素圈，生長速率由快到慢依次為：維生素B6≈維生素B1≈對照＞維生C≈肌醇≈維生B2。在維生素B6的培養(yǎng)基中，菌絲長勢優(yōu)于其他試驗(yàn)組，綜合菌絲生長速度和長勢，認(rèn)為該菌株的最適生長因子為維生素B6。

2.7 最適溫度

不同溫度對F1637菌株菌絲體生長影響見圖5。

有圖5可知，該菌株在各溫度條件下均能生長，生長速率由快到慢依次為：32℃＞30℃≈28℃＞26℃＞24℃≈37℃＞20℃。該菌株在不同溫度培養(yǎng)時均產(chǎn)生褐色色素；26℃～37℃菌絲生長速率較快，且較濃密，溫度過高或過低時，菌絲生長速率較慢。綜合生長速率和長勢，最適合該菌株生長的溫度為32℃。

2.8 最適pH

不同pH對F1637菌株菌絲體生長影響見圖6。

由圖6可知，該菌株在pH 4～9條件下均能生長，在中性偏酸環(huán)境中長勢最好，生長速率由快到慢依次為：pH 6≈pH 7＞pH 5≈pH 8＞pH 9≈pH 4。F1637菌株在pH為6時生長最快，產(chǎn)生產(chǎn)黃色色素。pH為5和7時，菌絲長勢良好，均產(chǎn)生褐色色素，但pH 5條件下菌絲成散射狀輻射。在pH為4時，菌絲較濃密，產(chǎn)生黃色色素。pH為8和9時，菌絲生長較稀疏，均產(chǎn)生褐色色素。綜合菌絲生長速率和長勢，該菌株生長的最適pH為6。

2.9 發(fā)酵液生物活性測定

F1637菌株經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)20 d后，發(fā)酵液還原糖、總糖及多糖測定結(jié)果表明，發(fā)酵液還原糖含量為 3.68 g·L-1、總糖含量為 16.69 g·L-1、多糖含量為 13.01 g·L-1。

3 討論

桑黃是一種名貴中藥，在我國有著上千年的藥用歷史，其主要藥用部分為子實(shí)體。以采集自北京小龍門國家森林公園的一株野生桑黃子實(shí)體為材料，獲得純培養(yǎng)菌株，編號為F1637。該菌株新鮮菌絲呈白色，成熟菌絲呈黃褐色，有隔、有分支、無分生孢子，未見鎖狀聯(lián)合，與戴玉成[8]對鮑姆纖孔菌報道基本一致。分別利用ITS與LSU-rDNA序列的分子鑒定結(jié)果表明，F(xiàn)1637菌株與鮑姆纖孔菌親緣關(guān)系最近，相似度為98%。結(jié)合形態(tài)與分子鑒定結(jié)果，確定該菌株為鮑姆纖孔菌。

由于野生桑黃資源有限，開展菌絲培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，是桑黃開發(fā)利用的必然途徑。F1637菌株菌絲體生長的最適碳源為山梨醇、最適氮源為酵母浸粉、最適碳氮比比為60∶1，最適生長因子為維生素B6、最適溫度32℃、最適pH為6。劉春靜等[24]報道，鮑姆纖孔菌菌絲生長的最適碳源為甘露醇和葡萄糖，最適氮源為蛋白胨，最適pH為6～8；劉紅錦等[25]報道，鮑姆纖孔菌菌絲生長的最適碳源為葡萄糖，最適氮源為蛋白胨，最適溫度為28℃，最適pH為6，在光照條件下比連續(xù)黑暗條件下生長更快。F1637菌株菌絲最適培養(yǎng)條件與前人報道接近，但有更高的最適溫度，表明該菌株為高溫型菌株。

多糖是桑黃的主要功能活性成分，包括子實(shí)體多糖、菌絲體多糖和胞外多糖[2，4]。F1637菌株以PD培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)20 d，發(fā)酵液中粗多糖含量為13.01 g·L-1。牛廣財?shù)萚26]報道，裂蹄纖孔菌（Inonotus linteus） 以糙米粉、豆餅粉、KH2PO4、VB2培養(yǎng)基、26℃、170 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，胞外多糖產(chǎn)量可達(dá)3.09 g·L-1。郭霞等[27]報道，裂蹄纖孔菌以蔗糖、玉米漿、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、VB1為培養(yǎng)基、7 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，胞外多糖在120 h達(dá)最大（3.28 g·L-1）。液體發(fā)酵后期，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，菌絲會自溶而釋放出菌絲體多糖。試驗(yàn)中F1637菌株發(fā)酵時間較長，有利于獲得更多的胞外多糖和菌絲體多糖。