口腔微生物菌群分布與兒童齲病的關系研究

馬 雙,李金義,劉朝基,蘭福升,趙彩霞,呂 婕,楊志偉

人口腔中菌群數量有700多種，其中鏈球菌群、韋榮氏菌群、奈瑟氏菌群是口腔中最常見的菌群，正常菌群過度繁殖會導致齲齒的發生和進展[1-2]。口腔內溫度、濕度適宜，營養來源豐富，為菌斑內細菌生長繁殖提供必要條件，也形成了動態平衡菌斑微生態系統[3]，當這種微生態系統平衡被打破，有致齲能力的產酸耐酸菌等增多，隨之菌斑出現即產生齲病[4]。因此，研究致齲菌與齲病發生發展的關系對預防齲病的發生有重要意義[5]。而致齲菌與兒童齲病發生發展的關系鮮有報道，本文旨在探討口腔微生物菌群分布對兒童齲病的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取本院2018年5月-2020年5月有齲(dmfs>6)患兒為患齲組，同期無齲(dmfs=0)患兒為對照組，每組30例。患齲組患兒男16例，女14例，年齡3～12歲，平均年齡(7.2±2.3)歲；對照組患兒男15例，女15例，年齡2～12歲，平均年齡(6.9±2.1)歲。2組患者基礎資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集：指導患兒用清水漱口，采集區域用無菌生理鹽水沖洗，棉卷作隔濕處理后刮取牙菌斑，對照組刮取正常牙面牙菌斑，患齲組刮取齲齒牙面牙菌斑，置放于100 μl TE緩沖液離心管中，經冰浴后轉運至實驗室，-20 ℃環境儲存。

1.2.2 菌斑DNA提取：樣本離心3 min后棄上清液，參照DNA提取試劑盒(Invitrogen公司)說明書方法提取。

1.2.3 16S rDNA PCR擴增(V3～V5)參照該片區引物序列：341f:5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’；907r：5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’，培養大腸桿菌相應的PCR產物。PCR程序流程：95 ℃ 5 min預變形，30循環；95 ℃ 30 s變性，58 ℃ 30 s退火，72 ℃ 30 s伸延，72 ℃ 10 min伸延。

1.2.4 DGGE分析：取用5 μl PCR產物經冰乙醇2.5倍體積壓縮沉淀，使用20 μl無菌水進行溶解。運用Bio-Rad公司生產的D-code System電泳儀行DGGE電泳分離。選用變性梯度25%～40%，濃度8%的變性梯度凝膠，1×TAE電泳緩沖液，在220 V預電泳30 min，隨后150 V持續電泳8 h，而后于溴乙錠染液染色15 min，凝膠成像儀拍照。

1.2.5 克隆測序及分析：挑選 DGGE 特異條帶，行PCR擴增，擴增產物連接T1載體，轉化后由感受態細胞進入，置于LB培養液培養。將培養菌液涂于IPTG及X-gal平板種培養，藍白斑篩選，分別挑選10個/每平板于LB培養液(含氨芐青霉素)接種，經37 ℃作24 h培養，挑選50個陽性克隆菌液送中美泰和生物技術有限公司測序。

1.2.6 菌群檢出率及細菌形態學鑒定：取用20 μl 10-1、10-2、10-3樣本稀釋液，于ROGOSA及MSBA培養平板進行接種，控制N2為80%、H2為10%、CO2為10%，經37 ℃作48 h培養。經肉眼可察MSBA平板典型變性鏈球菌菌落呈粗糙型、質硬及高凸，邊緣崎嶇，表層為磨玻璃樣。經革蘭氏染色并用油鏡查看其菌落為G+小球菌，呈鏈狀分散排列；Rogosa培養基上乳酸桿菌菌落呈白色，表面平滑，質地軟、有突起，經革蘭氏染色并用顯微鏡見乳酸桿菌為G+桿菌，呈長、短或棒狀，可單個、成對或成串排列。

1.3 納入標準及排除標準:納入標準，即：①符合美國兒童牙科學會頒布的《2014 AAPD嬰幼兒、兒童及青少年齲齒風險評估管理指南》中齲病診斷標準[6]并經由本院確診患兒；②年齡2～12歲；③經醫院倫理委員會審議通過，患兒家屬知悉同意。排除標準：①近3個月內有抗生素服用史；②全身系統性疾病；③牙周疾病患兒。

2 結果

2.1 2組細菌菌門、菌屬占比：60例研究對象牙菌斑中共檢出細菌菌門類5個，屬類28個，種系型88個，見表1。2組門類、屬類差異無統計學意義(P>0.05)，2組門類占比及菌屬檢出率差異有統計學意義(P<0.05)；對照組種系型67個，較對照組種系型的75個更低(P<0.05)，見表2。

表1 2組患兒菌門檢出率比較[n(%)]

表2 2組患兒菌屬檢出率比較[n(%)]

2.2 2組細菌基因型數目比較：患齲組經Real-Time PCR技術檢測，優勢菌屬中輕鏈球菌、血鏈球菌及口腔鏈球菌基因型數目均低于對照組(P<0.05)，變異鏈球菌及遠緣鏈球菌基因型數目與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，患齲組口腔牙菌斑總基因型數目低于對照組(P<0.05)，見表3。

表3 2組患兒牙菌斑基因型數目比較(個，

2.3 2組四種致齲菌檢出率比較：經Real-Time PCR技術檢測，患齲組遠緣鏈球菌、變異鏈球菌、內氏放線菌及黏性放線菌比例均顯著高于對照組(P<0.05)，見表4。

表4 2組四種致齲菌檢出率比較

3 討論

牙菌斑生物膜中的微生物在齲病病因學中有著重要地位，但導致齲病發生和發展的機制尚不明確。口腔內正常菌群因微生態環境改變而致菌群失調，是齲病發生的病因之一。本研究結果表明，60例研究對象牙菌斑中共檢出門類5個，屬類28個及種系型88個。患齲組擬桿菌門、梭桿菌門占比高于對照組；放線菌門、變形菌門、后壁菌屬占比則低于對照組(P<0.05)，患齲者的菌門種類較無齲者稍有減少。在菌屬水平上，菌屬檢出率可見齲病組普氏菌屬檢出率是對照組的一倍，而對照組鏈球菌和韋榮菌屬檢出率略高于齲病組。二氧化碳嗜纖維菌屬及放線菌屬檢查率基本持平，這與王少果等發現Firmicutes和SR1菌門，Rothia、Alistipes和Catonella菌屬的存在與齲病呈負相關，Scardovia等菌屬的存在與齲病呈正相關的結論一致[7]。這可能與隨著齲齒發展，口腔牙菌斑環境進一步發生變化，口腔整體環境pH值下降，二氧化碳嗜纖維菌屬等產酸、耐酸菌等成為優勢菌屬，可適應環境變化的細菌繼續繁衍生存，無法適應的細菌則相應減少有關。

實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)在細菌檢驗領域已應用多年，其檢測高效、準確[8]。本研究應用Real-Time PCR檢測到患者口腔菌群的改變，患齲組口腔牙菌斑總基因型數目少于對照組(P<0.05)，表明齲病患者菌群多樣性是受損減少的。患齲組牙菌斑中輕鏈球菌、血鏈球菌及口腔鏈球菌擴增的基因型數目較對照組明顯減少(P<0.05)，但變異鏈球菌及遠緣鏈球菌基因型數目與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，說明患齲組牙菌斑中輕鏈球菌、血鏈球菌及口腔鏈球菌口內正常菌群明顯減少，但變異鏈球菌及遠緣鏈球菌菌群相仿。此外，患齲組遠緣鏈球菌、變異鏈球菌、內氏放線菌及黏性放線菌比例均顯著高于對照組(P<0.05)，這可能與本研究對象為患齲兒童和健康兒童、重度低齡兒童齲患非常嚴重、口腔內均有大量已形成的齲洞有關。故在唾液中也含有大量齲洞中的變異鏈球菌和遠緣鏈球菌，因此，菌斑中二者檢出率高于對照組。此結果與文獻報告結果一致[9-10]。研究表明遠緣鏈球菌數量水平雖不如變異鏈球菌，但致齲潛能高于變異鏈球菌，耐酸、產酸能力均增強，在光滑面齲病起到關鍵作用[11]，在本研究2組四種致齲菌檢出率比較中也得到了驗證。而對放線菌屬中的內氏放線菌及黏性放線菌數量水平分析中，患齲組內氏放線菌及黏性放線菌數量較對照組顯著增高。其在齲齒菌斑呈酸化過程中，作為獲得性薄膜形成后的先鋒菌，促進了牙齒表面的黏附作用，使細胞凝集能力增強。其數量水平可對患兒齲病嚴重程度作初步判別，在菌斑形成及齲病發生機理的了解上具有重要作用。上述關鍵致病菌的檢出是齲病兒童患齲情況的重要依據。

綜上所述，與健康兒童相比齲病患兒口腔微生物菌群多樣性減少，其中4種致齲菌遠緣鏈球菌、變異鏈球菌、內氏放線菌和黏性放線比例升高，明晰了齲病的主要致病菌種類，為預防兒童齲病提供了一定的理論依據。