先天性肌強直一家系的臨床與基因分析

曹小麗 覃秋燕 黃 文

廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530021

先天性肌強直(myotonia congenita，MC)作為一種罕見的遺傳性骨骼肌離子通道肌病首先由EULENBERG提出[1]，發病率僅為(0.3～0.6)/10萬[2]。該病主要特點為肌強直及短暫無力，屬常染色體顯性或隱性遺傳，由SCN4A或CLCN1基因突變所致[3-4]，兩種基因突變所致的疾病類型有廣泛的表型重疊，臨床變異性較大[5-7]。其中氯離子通道(chloride channel 1，CLCN1)基因為特異表達于骨骼肌的電壓門控通道，位于7q35區，大小為36 kb，有23個外顯子，共988個氨基酸位點，編碼CLCN1蛋白。由于CLC1蛋白并無S4電壓感受器，僅有兩個三角形結構形成同源二聚體結構，有兩個狹小孔道呈雙螺旋對稱排列于二聚體中心，每個亞基由18個α螺旋組成，N末端與C末端的多肽結構類似，且均傾斜于膜內，但膜內走向相反，形成特殊的相互圍繞的假二倍對稱的獨立Cl-通道孔洞，因此其單通道電導雖僅1-1.5pS，但已達到靜息狀態下總膜電導的70%～85%[5]，因此任何原因引起單個通道的結構變化均可顯著影響蛋白功能。一般認為CLCN1基因突變所致的先天性肌強直臨床表現型可分為顯性(Thomsen)和隱性(Becker)兩種，顯性遺傳由突變位點所在亞基對復合突變位點或野生型通道的顯性負效應實現，氯電流阻斷試驗中可誘導激活曲線向正性膜電位漂移，使整個氯離子電流電導下降，出現肌強直；隱性遺傳則是由于突變引起的功能喪失效應所致，如開放概率降低，單通道電導降低或生化穩定性變化，但均不會顯著影響氯離子通道二聚體結構的形成或功能，這類突變體在肌強直藥物試驗中阻斷50%的生理性氯電流亦不能產生強直性活動，因此無臨床表現或僅有輕微損害[8]。

CLCN1基因目前已有200多個突變位點被發現[9-10]，突變位點可出現于基因全長，其中8號外顯子為突變熱點，有插入、缺失、剪切、移碼等形式，80多個被證實為功能性突變。SUN等[11]發現30%～ 60%先天性肌強直患者的臨床診斷結論與基因檢測及致病性分析結果相悖，提示作用機制復雜，其發病機制仍不清楚。本研究對疑似先天性肌強直的一家系進行了臨床和CLCN1基因突變分析，試圖為該病發病機制研究提供新的資料，提高對這一臨床罕見病的認識。

1 對象與方法

1．1臨床資料先證者：男，24歲，漢族，祖籍廣西，主訴“雙手握拳后張開困難10余年，加重半年”于2019-01來廣西醫科大學第一附屬醫院就診。患者足月順產，自幼智能及體格發育與同齡人無差異。自8歲起發現雙手緊握拳后難以松開，上肢平舉時伸直費力，長時間維持相同姿勢后再活動起動困難，反復活動后可緩解，天氣轉冷時發作無變化，無肌肉疼痛、萎縮及肥大，無感覺異常，叩擊雙側上臂未見肌球，智能正常。體格檢查：高級神經活動及腦神經未發現異常，淺感覺無減退，四肢肌力肌張力正常，未見明顯萎縮或肥大，腱反射對稱，病理征陰性。輔助檢查：電解質正常，肌酸激酶245 U/L(參考值：26～140 U/L)，血乳酸、甲功、電解質和顱腦MRI+MRA檢查未見異常。電生理檢測：針極肌電圖提示所檢肌肉肌強直放電，未見神經源性及肌源性損害。

家族史：患者就診6個月內完成家系調查，父系三代共5人患病，患者爺爺、姑姑、大姐及父親有類似癥狀，其中(I1)爺爺已去世，(II3)父親自幼有類似癥狀，表現輕微，不影響日常生活，患病姑姑(II4)癥狀與父親相似，未婚育；大姐(III2)27歲，自幼有乏力、手足僵硬不適，隨年齡增長上述癥狀逐漸減輕。家系圖譜見圖1。

1．2研究方法

1．2．1 高通量外顯子測序與Sanger測序驗證：在征得受試者同意并簽署書面知情同意書后，空腹采集先證者外周靜脈血5 mL，抽提基因組DNA，磁珠純化法處理DNA并PCR擴增，擴增后連接接頭序列，用TruSight One Sequencing Panel(illumina Inc，USA)兩次捕獲并純化，再次PCR擴增和純化后將獲得的文庫在MiSeq測序儀(illumina Inc，USA)對4 811個與臨床疾病相關的基因外顯子區進行測序。根據人類基因突變數據庫(human gene mutation database，HGMD Professional)、在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)、Gene Tests網站 (www.genetests.org)、Illumina，最終納入候選基因。尋找致病突變基因并Sanger測序驗證，獲得突變位點后對患者家族中父母、兩位姑姑、叔叔及兩位姐姐進行PCR驗證；同時選取本課題組標本庫中50例健康人DNA樣本作為對照組，利用同一引物進行PCR檢測。

注：先證者，□正常表型男性，●患病女性，○正常表型女性，■患病男性圖1 CLCN1基因突變所致先天性肌強直先證者家系圖，父系三代中先證者爺爺父親大姐及一位姑姑有類似癥狀，其他人表型正常Figure 1 Pedigree of the family with CLCN1 gene mutation-related myotonia congenita.In this family.The proband and his grandfather，father，elder sister and aunt were patients with myotonia congenita，while other family members were healthy

1．2．2 氨基酸序列保守性及突變致病性分析：運用UGENE軟件進行不同物種氨基酸序列保守型分析，同時采用poly2 phen軟件( http：//genetics.Bwh.Harvard.edu/pph)進行致病突變性分析。本研究經廣西醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準。

2 結果

2．1先證者及親屬基因檢測先證者CLCN1基因(NC_000007.14)存在c.1879A>C位點突變，該突變為錯義突變，導致編碼氨基酸由蘇氨酸變為脯氨酸(p.T627P)，先證者的大姐、姑姑及父親分別利用設計的引物進行擴增。PCR結果證實其父親、姑姑及大姐均有同一突變，而母親和二姐未發現該突變(圖2)，利用UGENE軟件對不同物種CLCN1基因編碼的氨基酸序列作比較分析。根據對比分析，CLCN1基因突變位點區域所編碼蛋白氨基酸序列在不同物種間保守性不高(圖3，箭頭示突變位點編碼脯氨酸所在區域) 。

圖2 先證者和其母基因檢測結果，先證者存在c.1879A>C位點突變，其母未發現該位點突變Figure 2 Sanger sequencing results of the proband and his mother，heterozyous mutation CLCN1 c.1879A>C was identified in proband，while no mutation was detected in his mother

2．2治療僅先證者及其大姐同意接受小劑量美西律(200 mg/d)治療，并配合門診隨診，半年后隨訪結果顯示上述癥狀有所減輕。

3 討論

本研究中先證者為幼年起病的肌強直與運動笨拙，癥狀主要分布于面部和上肢，叩擊后可見肌球，常伴發數天肌無力癥狀，肌肥大不明顯，肌電圖示肌強直電位，肌酶不高。對患者進行了家系調查和生物信息學分析，高通量測序及Sanger驗證在先證者中均發現CLCN1基因c.1879A>C突變，經驗證家系中其他3名患者也存在CLCN1基因c.1879A>C突變，而健康家族成員則未發現攜帶該突變，家系中突變與疾病呈共分離。對照組基因檢測結果排除了該位點為單核苷酸多態性位點可能，可認為CLCN1基因c.1879A>C為基因突變位點，診斷后予美西律治療有效，符合經典先天性肌強直表現，家族中其他患者癥狀類似，因而診斷為先天性肌強直家系。

目前CLCN1基因突變導致肌強直的機制目前并不十分明確。IMBRICI等[12-13]分析了體外細胞表達系中多個突變位點，通過分子動力學分析發現F484L通過改變介于螺旋結構F.E232以及螺旋結構R.Y578之間的H環結構影響慢通道，引起慢通道右移；p.L198P和p.G270V則改變了慢通道的正向電位，p.V640G降低了通道的反應性，而p.G190S和L628P突變通道的行為與野生型相似，結合其他研究可認為除部分突變位點因為物理距離原因可直接改變通道結構外，氯通道跨膜結構域的同源二聚體化結構模式很可能適用于整個蛋白，因此部分突變C末端結構域雖與通道的孔道距離較遠，卻對通道的傳導和門控特性有較大的影響，甚至會導致通道喪失正常功能；還有些突變雖不改變蛋白的拓撲結構與功能，卻在其他因素共同作用下，如細胞內外PH值等影響電壓門控通道的開放，導致臨床出現肌強直現象[14]。c.1879A>C位于14號外顯子，為錯義突變，導致627位編碼氨基酸由蘇氨酸變為脯氨酸(p.T627P)。該突變位于胱硫醚-β-合成酶蛋白合成區域1(氨基酸位點為609-668)[15-16]。已有多個突變位點與c.1879A>C在類似，氨基酸序列保守分析及致病性評分較低而臨床表現為肌強直，尤其是與之相鄰的突變位點L628P在電生理學表現類似野生型，而有臨床的肌強直癥狀，推測T627P突變作用機制可能與L628P相似。在爪蟾卵母細胞和HEK293細胞中，通過分子動力學分析包括L628P在內12個CLCN1基因變異體，電流活動與野生型幾乎無差別[12]。RONSTEDT等[17]以YFP及CFP融合蛋白標記，用全細胞膜片鉗及單細胞熒光標記方法，分析了四種致病突變Q43R、S70L、Y137D和Q160H，這一系列突變在不同物種中氨基酸序列保守性和致病性分析評分并不高，但前3個突變尤其是Q43R/Q43R同二聚體或WT/Q43R異二聚體亞基對膜表面門控通道的影響遠大于野生型，影響了通道整體電流幅度，但對單個通道電流及氯離子通道的結構無影響，提示這類突變體可能存在更復雜的致病機制。基因小鼠、多能干細胞技術以及基因編輯的方法可以為進一步的先天性肌強直機制研究提供方法[12，18-19]。

先天性肌強直無特效治療方法，傳統藥物如美西律、卡馬西平可能有效[20-29]。阻斷鈉離子通道功能，提高鉀通道活性的鉀通道激活劑瑞替加濱可以影響靜息電位，縮短肌強直的時間[30]。有患者在服用雷諾嗪(500 mg，2次/d)后，僵硬、虛弱和疼痛明顯好轉，計時“起立-行走”測試、手僵硬、眼瞼肌強直以及肌電圖測試亦有改善[31]。

通過對這一家系的分析發現，在CLCN1基因存在一個新的基因突變位點c1879A>C突變，該突變在家系中與表型共分離，對美西律反應較好，可認為CLCN1基因c.1879A>C突變是導致該家系先天性肌強直的病因，證實了該突變基因在先天性肌強直發病中的作用，為在中國先天性肌強直家系中發現了新的CLCN1突變位點，為研究中國人群CLCN1突變類型、遺傳方式及機制研究提供了一定的參考。