膠原-殼聚糖支架對脊髓損傷后運動功能恢復作用的實驗研究

朱 旭 于國淵 楊華堂 張 寧 王喜旺 王 晶 王如科

邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056000

隨著人類交通工具使用的不斷增加，脊髓損傷(SCI)的發病率也與日俱增，SCI的高致殘率給社會帶來沉重的負擔。脊髓局部不利于神經修復的主要原因是損傷后各種炎癥因子的刺激，脊髓液化及空洞形成，膠質瘢痕增生及髓鞘抑制因子等共同作用導致。因此，SCI的治療成為醫療界的一個巨大挑戰[1-5]。最近研究表明，在給予足夠的神經營養和適宜的生長環境下，破壞后的人類中樞神經系統可以緩慢的進行再生[6]。根據這項神經系統的特點，啟發人們通過各種手段和方法來引導神經系統的再生，并且支持幫助神經軸突穿過損傷后的瘢痕組織，扭轉抑制因子形成的微環境來治療SCI。近年來，組織工程學支架的發展為脊髓的修復和再生提供了治療思路[7-8]。

利用組織工程仿生支架的多孔性為中樞神經纖維的攀爬提供橋梁，為軸突的延長和生長提供足夠的物理和化學支撐；利用其生物相容性填補脊髓空腔；利用其低免疫原性重塑損傷后局部脊髓的微環境，減少損傷部位的膠原沉積和纖維性瘢痕形成[9-10]。目前該治療方法以成為SCI研究的熱點。另外，脊髓損傷后局部的病理生理及化學因素的改變對中樞神經的再次生長發育也起到了至關重要的作用。改善病理生理過程并幫助神經纖維抵抗各種炎性因子抑制是優質的支架材料必須具備的化學及生物特性[11]。眾所周知，脊髓橫斷切斷了大腦對脊髓的控制，導致對應的肢體運動功能和皮膚的痛溫觸覺及本體感覺的喪失。由于中樞神經系統的自我恢復能力和再生能力非常差，損傷后復雜的病理過程進一步增加了修復的難度。因此，SCI的致殘率和致死率極高，臨床治療難度大，預后差。為神經的再次生長和發育提供營養支持,誘導神經纖維連接并形成完整的神經傳導通路是目前探索治療SCI的主要研究方向[12]。本試驗通過大鼠 BBB評分和電生理活動評價各組大鼠后肢運動功能的恢復、HE染色和NF免疫熒光染色觀察支架修復脊髓損傷的效果。本研究運用膠原-殼聚糖支架移植到全橫斷脊髓損傷處，探討這種支架對運動功能的影響，為臨床治療脊髓損傷提供依據。

1 材料與方法

1．1支架制備選擇新鮮牛肌腱，取剔除外膜及周圍脂肪后剩余的結締組織，用攪拌機充分研磨粉碎，在置入高速離心機離心之前先用0.05 mol/L Tris緩沖液浸泡10 h，離心后可得到乳白色的混懸液，靜置后收集沉淀。配置含有消化蛋白酶的醋酸溶液，持續攪拌至蛋白酶完全溶解。將醋酸溶液加入到收集的乳白色沉淀中，待沉淀充分溶后解取上清液。利用鹽析法收集鹽析出的沉淀物并在4 ℃去離子水中充分清洗溶解，獲得膠原蛋白凝膠。另外，將研磨后的殼聚糖粉末倒入醋酸溶液中，充分攪拌直至完全溶解，按殼聚糖∶膠原質量比1∶3的比例將溶有殼聚糖的醋酸溶液與膠原蛋白凝膠混合，充分攪拌后高速離心。去除上清液后在4 ℃去離子水中充分清洗獲得預膠化的混合材料,密封備用。將膠凍狀的支架材料取出后置于實驗型真空冷凍干燥機中24 h得到固定形態的多孔隙的脊髓仿生支架。用1%的NaOH 溶液浸泡支架12 h，反復沖洗，裁剪為3 mm×3 mm×3 mm的圓柱體，60Co滅菌后備用[13-14]。

1．2大鼠脊髓全橫斷模型的建立本實驗的大鼠由軍事醫學科學院動物飼養中心提供。將 30 只雌性 SD大鼠適應性喂養1周，2 d更換草料，充分喂食，術前禁食不禁水8 h。采用腹腔注射麻醉，麻醉劑選擇5%水合氯醛(7 mL/kg)。待大鼠完全麻醉后俯臥固定。在背部皮毛上均勻噴灑適量酒精噴霧劑清潔背部，待毛發干燥后用電剃刀剃除背部毛發,暴露皮膚,碘伏常規消毒。觸摸脊柱,確定 T8-10棘突的位置,沿脊柱正中切開皮膚,切口約4 cm，鈍性分離脊柱兩側肌肉組織。用金屬推開器推開雙側的肌肉組織,充分暴露 T8-10棘突。止血鉗提拉錐體，暴露脊柱間隙，利用咬骨鉗咬開缺口并擴大，直至完全咬除對應的脊柱骨板，注意盡量沿正中方向咬除骨質暴露脊髓，避免損傷雙側靜脈竇引起大出血，增加手術病死率。小鼠專用手術顯微鏡下用剪刀片沿正中劃開脊髓的硬脊膜。將單根血管縫合線從脊髓底部穿過脊髓并提拉。眼科剪橫斷脊髓,大鼠雙側后肢抽搐數次后肌肉松弛無力，針刺無反應提示造模成功[15]。血凝酶減少出血，促進血液凝固，待術野完全干凈后植入膠原-殼聚糖支架。術后大鼠分開低密度喂養，每日傷口碘伏消毒，腹腔注射青霉素預防感染，擠壓膀胱輔助排尿，投放干果餅干等加強營養。加強手術切口護理，如出現傷口裂開及時處理，防止發生啃食現象。將實驗動物隨機分為3組，每組10只，分別為：(1)正常對照組(SHAM 組)；(2)單純損傷組(SCI組)；(3)膠原-殼聚糖支架組(SCI+S組)。

1．3BBB運動功能評分 SCI術后每周在固定時間用BBB評分量表評估各組大鼠的雙后肢運動功能[16]。

1．4電生理檢測分別于術后即刻、術后1個月和術后2個月分別檢測各組大鼠(n=5)雙后肢運動電生理(motor evoked potentials MEP)活動。5%水合氯醛(7 mL/kg)腹腔注射麻醉。麻醉后固定在手術臺。去除毛發并消毒后沿正中矢狀切開頭部皮膚及雙下肢測量電極放置區域的皮膚。參比電極沿肌肉走行插入。誘發電位儀通過刺激大鼠肌肉記錄運動誘發電位(MEP)的潛伏期、波幅及波形。將刺激電極置于冠狀縫和矢狀縫交叉處的皮質運動區，記錄電極放置于脛后神經,刺激后在電位儀上記錄MEP潛伏期、波幅及波形。每組5只大鼠,取平均值。

1．5HE染色造模后8周，將大鼠灌流后取出脊髓組織固定在4%多聚甲醛溶液中，石蠟包埋切片，后做HE(hematoxylineosin staining)染色。顯微鏡下觀察脊髓斷端瘢痕形成與修復及周圍組織形態學的改變。經過Photoshop和IPP軟件分析脊髓橫斷處再生的組織面積，得出脊髓損傷處的損傷修復程度百分比。

1．6NF免疫熒光染色造模后8周，將所有實驗大鼠T7～T12脊髓行神經絲蛋白-200(NF-200)的免疫熒光染色，確定神經纖維的再生情況。將固定處理好的脊髓標本組織進行冰凍切片。含Triton-X 100的PBS常溫透化處理20 min，PBS緩沖液洗3次，5 min/次。5% 的BSA，室溫孵育20 min。滴加NF一抗，4 ℃過夜，PBS緩沖液洗3次，5 min/次。滴加相應二抗，37 ℃避光孵育50 min，PBS緩沖液洗洗3次，5 min/次。封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察。經過Photoshop和IPP軟件分析經脊髓損傷處的熒光相對密度，從而計算脊髓損傷處NF的百分比。

2 結果

2．1支架的外觀真空冷凍干燥機冷凍干燥后得到S支架(圖1A)。冷凍干燥后S支架質地柔韌，尺寸與大鼠脊髓接近(圖1B)。

2．2成功建立大鼠全橫斷損傷模型圖1C～F為造模的步驟。掛線法將縫合線穿過暴露的脊髓底部，提拉起脊髓后用手術剪刀離斷，確保徹底離斷脊髓組織。離斷瞬間大鼠雙下肢劇烈抽搐數次后各個關節松弛，無牽拉反射，提示造模成功。

圖1 A：直接冷凍干燥的膠原-殼聚糖支架；B：裁剪后的膠原-殼聚糖支架；C：暴露脊髓節段；D：掛線法；E：全橫斷脊髓后形成的空腔；F：植入支架Figure 1 A：Direct freeze drying ofcollagen-chitosan scaffold；B：Cut into certain shape；C：Exposure of spinal cord segments；D：Hanging line method；E：The cavity formed after complete transection of the spinal cord；F：Scaffold implantation

2．3雙后肢運動功能的恢復術后1周，各組大鼠后肢功能無明顯恢復，BBB 評分組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。術后2周開始SCI+S組BBB評分均明顯高于SCI組，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖2)。

電生理是臨床上被廣泛認可的評價神經功能強弱的方法，根據神經傳導的方向及功能分為測量運動功能的誘發電位；測量感覺功能的體感誘發電位。電位的潛伏期和振幅分別代表神經纖維傳導的速度和興奮性。該實驗對脊髓損傷術后即刻、術后1個月和術后2個月后對各組大鼠進行電生理檢測。從MEP的波形圖和統計圖可以看出，在術后即刻SCI組和SCI+S的波形幾乎檢測不到(圖3A～C)。在術后1個月和術后2個月，SCI組的潛伏期比SCI組的潛伏期明顯更低(P<0.05)(圖3A～B)，SCI+S組的振幅比SCI組明顯更高(P<0.05)(圖3A和圖3C)。

圖2 SHAM組、SCI組和SCI+S組大鼠造模后1～8周的BBB評分值比較Figure 2 The comparison of the BBB scores of sham group，SCI group and SCI + s group during 1-8 weeks after modeling

圖3 造模后即刻、術后1個月和術后2個月電生理檢測 A：3組MEP波形圖；B：3組MEP潛伏期；C：3組MEP的振幅Figure 3 Electrophysiological examination immediately，1 month and 2 months after operation．A：Waveforms of MEP in three groups；B：Latency of MEP in three groups；C：Amplitude of MEP in three groups

2．4HE染色HE染色顯示脊髓仿生支架植入體內2個月后對脊髓損傷的修復作用。圖4展示為HE染色。SCI組 HE染色大體圖，脊髓斷端有明顯的瘢痕增生，脊髓神經元大量死亡丟失形成空洞 (圖4B 和圖4E)。SCI+S組織結構緊湊致密，修復作用明顯優于SCI組，瘢痕和空洞較少，SCI+S結構完整性明顯優于SCI組(圖4B、圖4E、圖4C和圖4F)。相比單純損傷組，植入S支架組明顯增加脊髓損傷處的損傷修復程度百分比，有顯著性差異(P<0.05)(圖4F)。

圖4 造模后2個月的3組HE染色 A、D：SHAM組的HE染色大體圖；B、E：SCI組HE染色的大體圖；C、F：SCI+S組HE染色的大體圖；G：3組脊髓損傷處損傷修復程度百分比Figure 4 HE staining performed in three groups two months after modeling．A and D：HE stained for the sham group；B and E：HE stained for the SCI group；C and F：HE stained for the SCI+S group；G：The percentage of repair degree of spinal cord injury in three groups

2．5NF免疫熒光染色圖5為脊髓全橫斷后2個月的NF免疫熒光染色。SHAM組可見大量的具有連續性的NF陽性纖維(紅色)(圖5A)。SCI組未見明顯具有連續性的神經纖維(圖5B)。SCI+S組比SCI組可見較多具有連續性的神經纖維(圖5C)。SCI+S組脊髓損傷處NF百分比明顯比SCI組的更高，差異有統計學意義(P<0.05)(圖5D)。

圖5 造模后2個月的NF免疫熒光染色 A：SHAM組NF熒光；B：SCI組NF熒光；C：SCI+S組NF熒光；D：3組脊髓損傷處的NF百分比Figure 5 NF immunofluorescence staining 2 months after modeling．A：NF immunofluorescence staining of the SHAM group；B：NF immunofluorescence staining of the SCI group；C：NF immunofluorescence staining of the SCI+S group；D：Percentage of NF at spinal cord injury in three groups

3 討論

脊髓損傷后導致臨床治療效果不佳的主要原因是局部膠質瘢痕的形成，神經傳導束的離斷和大量神經細胞凋亡[17-18]。因此，如何克服局部瘢痕障礙同時促進神經元軸突再生、重建神經通路是脊髓損傷治療的關鍵方面。組織工程的發展為脊髓治療提供了新的治療思路，通過合成材料的介入克服神經修復的難題，并在試驗探索中取得良好的效果[19-20]。本實驗采用真空冷凍干燥的脊髓支架治療SCI。這種支架結構可以誘導斷裂的神經纖維再次連接并形成完整的神經傳導功能，為損傷的脊髓組織提供優良的神經生長環境[21]。

天然材料比人工合成材料具有更多的應用優勢，如良好的生物相容性、適宜的生物降解性、形態重塑性強、人體免疫反應低。因此，天然材料被廣泛應用于組織工程，生物醫學等領域。但是，天然材料最明顯的缺點是力學性能差，無法為組織提供足夠的力學支撐。天然材料中，目前人類發現的最理想的用于生物組織的天然材料便是膠原。已有研究證實，將膠原蛋白作為支架植入損傷的脊髓內可以延長神經細胞存活時間并促進軸突生長[22]。組織工程學支架是否適合作為植入物植入到生物體內，其本質是考驗該種支架的理化性質，其中最重要的能夠促進脊髓順利修復的性質是適宜的吸水率、孔隙率和降解率[23-25]。同時還需要有模擬脊髓硬度和彈性的力學性能[26]。膠原材料的多孔性為中樞神經纖維的攀爬提供橋梁，為軸突的延長和生長提供足夠的物理和化學支撐；生物相容性填補脊髓空腔；低免疫原性重塑損傷后局部脊髓的微環境，減少損傷部位的膠原沉積和纖維性瘢痕形成[27]。然而降解速度快、力學性能差導致膠原無法單獨使用，因此需要結合其他材料來彌補膠原材料的缺陷[28-29]。殼聚糖具有良好的延展性，有利于中樞神經細胞和軸突的依附，有利于刺激神經細胞的合成分泌生長因子及營養因子等優點[30]。聚糖是一種長而不分支的黏多糖為主體，在糖的某些部位上共價結合若干肽鏈而生成的復合物。可在一系列細胞外酶或溶酶體中細胞內酶的催化下進行降解，是藥物攜帶的最佳載體。利用殼聚糖的高力學性能彌補天然材料的缺陷，將殼聚糖與膠原蛋白交聯提高膠原支架機械強度[31]。大鼠后肢肌肉收縮強度和運動功能的恢復是組織工程應用臨床治療SCI的最終目標。本實驗應用多種手段檢測不同時間段組織工程仿生學支架對損傷后大鼠后肢功能恢復的作用。活體中采用運動功能評分(BBB評分)和電生理評價雙后肢感覺運動及協調功能的恢復。離體后主要通過脊髓 HE 染色評價組織工程學支架對損傷后促進神經再次生長和發育并完成神經傳導及功能恢復等方面作用;本實驗不僅從大體層面證明支架對脊髓修復具有積極的作用，更進一步通過微觀角度進一步證明組織工程學支架的有效性，增加了本實驗的說服力。結果顯示SCI+S組的治療效果明顯優于SCI組，表現在運動功能評分(BBB 評分)和電生理評價明顯優于SCI組。與運動功能恢復相一致的是，從 HE染色和 NF 免疫熒光染色的結果可以得出，相比SCI組，支架治療組從微觀層面解釋了改善了脊髓損傷后的病理過程，減輕水腫，減少瘢痕形成的原因，并證明了該支架可以明顯促進神經再次生長和發育并完成神經傳導，具有良好的臨床應用前景。

膠原-殼聚糖支架減輕組織空洞和膠質瘢痕的形成，促進脊髓神經纖維再生和運動功能的恢復。