檸檬苦素抑制乳腺癌細胞轉移相關基因芯片分析

凌 珺， 劉伯霞， 李 濤， 陳 靜

（1.寧夏醫科大學基礎醫學院，銀川 750004； 2.寧夏回族自治區生育力保持教育部重點實驗室，銀川 750004；3.寧夏醫科大學總醫院腫瘤外科，銀川 750004）

乳腺癌嚴重威脅女性生命健康，具有惡性程度高、轉移性強的特征[1-2]。現階段針對乳腺癌的治療方法常為手術治療和藥物治療，因其副反應較為明顯，近幾年臨床出現的靶向治療[3]尤為重要。腫瘤轉移是一系列連續的過程。惡性腫瘤的典型特征是腫瘤轉移，其過程的發生不僅需要基質蛋白酶、細胞因子和多種黏附分子的參與[4-5]，還需要相關基因及信號轉導機制等發生改變。有研究表明信號轉導與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在癌細胞的增殖、分化中起著關鍵的作用[6-8]。柑橘內含有的檸檬苦素對癌癥可以起到很好的預防治療效果[9-12]，且經過體外誘導凋亡等實驗發現在多種人類腫瘤細胞系中（如乳腺癌、肺癌、骨肉瘤和結腸細胞等）均顯示出相應的抗癌潛力[13-15]。

基因芯片技術現已成為研究人類疾病發生中分子機制的一個主要方法[16-17]。人們常選用基因芯片技術來分析腫瘤的分型從而確定臨床下一步治療方案及靶向藥的選擇[18]。基于此，本課題組希望利用生物信息學手段，通過分析經檸檬苦素作用后，乳腺癌細胞基因的改變，來尋找其發揮作用的分子機制及關鍵靶標，為檸檬苦素抑制乳腺癌細胞轉移提供更充分的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設備 二氧化碳培養箱（力康生物醫療科技控股有限公司）；4 ℃低溫離心機（Eppendorf 公司）；ABI 9700 RCR 儀（ABI 公司）；全波長酶標儀、Nanodrop2000、GeneChipHybridization Oven 645、GeneChipFluidics Station 450、GeneChipScanner 30007G（Thermo Fisher公司）。

1.1.2 細胞、試劑與分組 三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231（美國Type Culture Collection 公司）。細胞用含有10%胎牛血清（MultiCell Technologies公司）的RPMI-1640 培養基（MultiCell Technologies 公司）并且在37 ℃、5%CO2培養箱中培養。檸檬苦素20 mg（limonin）（上海融禾醫藥公司）。將乳腺癌MDA-MB-231 細胞株按照2×106的密度培養在直徑為10 cm 培養皿中；待細胞貼壁后，分別用不同濃度的檸檬苦素（0、40、60 μM）進行處理，將收集的細胞分為對照組C（未經檸檬苦素處理的三個對照組C1、C2、C3）及6 個實驗組T（經40 μM 檸檬苦素處理的三個實驗組T1、T2、T3，經60 μM 檸檬苦素處理的三個實驗組T4、T5、T6）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和總RNA 提取和純化 細胞經檸檬苦素處理24 h，細胞貼壁程度達到85%～90%后，用PBS 進行清洗，隨后加入TRIzol 反復吹打，待細胞充分裂解后，離心收集細胞。離心收集后的細胞室溫靜置5 min，使復合物充分分離。加入氯仿后，充分震蕩15 s，靜置3 min。4 ℃、12000 r·min-1離心10 min，吸取上清。加入異丙醇，上下充分顛倒混勻后，靜止10 min，4 ℃、12000 r·min-1離心10 min，棄去上清，用75%乙醇洗滌沉淀，室溫靜置5 min 充分干燥后，加入DEPC 輕彈溶解RNA，55～60 ℃放置10 min，使RNA 充分溶解。-70 ℃進行保存。提取總RNA 濃度和質量采用分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳測定，總RNA 純化的詳細步驟嚴格按照3’IVT PLUS Reagent Kit 操作。

1.2.2 數據標準化處理和差異基因（DEGs）的篩選 將樣本處理后的基因數據集用Robust multi-chip average（RMA）進行統一性處理，通過R-package Combat 去除批次效應（batch effects）后，利用R 語言中的Limma 包初篩后得出差異基因[19-20]。以校正后的P＜0.01，|log2FC|＞1為篩選標準，得到不同檸檬苦素濃度處理后的實驗組較對照組顯著上調、下調的差異基因，并以對照組的基因芯片為驗證集，考察所篩選出來的差異基因表達值與聚類區分度。根據樣本類型和基因表達量，使用MEV4.9.0（multi experiment vie-wer）繪制基因聚類熱圖。

1.2.3 GO 功能注釋和KEGG 富集分析 采用DAVID 6.8 數據庫，通過GO 功能富集（gene ontology，GO）及KEGG 功能富集（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）對差異基因進行分析[21-22]。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件對數據進行統計學分析，檸檬苦素藥物處理組與對照組之間的差異采用t 檢驗。差異基因GO 功能注釋和KEGG 富集采用超幾何分布分析。實驗結果用均數±標準差（±s）表示，P≤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 差異表達基因

初篩得到的差異基因中選擇服從P＜0.01、|log2FC|＞1 標準的差異基因為此次研究的目的基因。在對照組及不同濃度檸檬苦素處理的實驗組中，篩選出有表達差異的基因438 個，這些基因中包含81 個基因的表達顯著上調和63 個基因的表達顯著下調（差異均在2 倍以上）。聚類熱圖用于表示這些基因在對照組和不同濃度檸檬苦素干預的實驗組中表達的情況。檸檬苦素抑制了STAT3 及大多數下游目標基因的表達水平，尤其人類1 型胰島素樣生長因子受體（the human type 1 insulin-like growth factor receptor，IGF-1R）、胰島素樣生長因2（insulin-like growth factor-2，IGF2）、環磷酸腺苷反應元件結合蛋白1（Cyclic AMP response element-binding protein 1，CREB1）和真核細胞翻譯起始因子4E（Eukaryotic translation Initiation Factor 4E，EIF4E）的表達呈現明顯下調趨勢，差異值在2 倍以上，見圖1。

2.2 GO 富集分析和KEGG 富集分析

GO 分析顯示，下調的DEGs 顯著富集在生物學過程中包括跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、信號轉導調控、對生長因子的反應等。在分子功能中下調的DEGs 富集于細胞運動的調節、細胞-底物黏附、細胞遷移的調控等，見圖2。GO 細胞成分分析顯示，下調的DEGs 富集于血管發育、維管系統發育、血管形態發生學、血管再生。同時在KEGG 通路富集分析結果發現，差異基因主要富集于血管生成途徑、胰島素受體信號傳導途徑和NF-κB 信號通路等，見圖3。

3 討論

目前基因芯片技術已用于臨床腫瘤研究，尤其在乳腺癌的研究中有了極大的進展[23-25]，促進了乳腺癌的分子分型，推動了臨床的靶向治療。本研究通過基因芯片檢測未經檸檬苦素處理的乳腺癌細胞和不同濃度檸檬苦素處理的乳腺癌細胞基因表達情況，共得到表達差異的基因438個，這些基因中包含81 個基因表達的上調和63個基因的表達下調。由于基因芯片是高通量的檢測技術，其影響因素較多，難免出現假陽性。為了加強本次基因芯片結果的準確性，每組實驗均獨立重復3 次。

乳腺癌是發生在乳腺上皮組織最常見的惡性腫瘤[2]，其高發病率和病死率已成為危害世界女性生命健康的主要原因。目前，我國乳腺癌發病率和病死率也處于逐步上升的趨勢，其中腫瘤轉移是導致死亡的重要因素。乳腺癌的轉移與其他腫瘤轉移類似，都是一個復雜的生物學過程。在腫瘤轉移的過程中，細胞轉錄因子STAT3 發揮著關鍵作用[26]。STAT3 發揮著調控細胞的增殖、侵襲、遷移和血管生成的作用，同時影響著腫瘤的生長和轉移[27-28]。

檸檬苦素是柑橘的主要活性成分之一，現已被安全地用作營養和促進健康的膳食補充劑。雖然作為一類中草藥單體化合物，但有研究[29]證實其具有的抗腫瘤作用，能夠抑制腫瘤的生長。本研究通過設置對照組與不同濃度干預的實驗組進行基因芯片表達譜差異分析，從中篩選出關鍵的差異基因，對差異基因進行功能注釋和通路富集分析。從基因芯片分析的結果發現檸檬苦素抑制了乳腺癌轉移相關大多數下游目標基因的表達水平，尤其是IGF2、IGF-1R、CREB1、EIF4E 的表達均呈現下調趨勢。有研究報道[13，30-32]，IGF2、IGF-1R、CREB1、EIF4E 與乳腺癌的轉移及其惡性進展過程密切相關。其中，IGF2 是肝臟分泌細胞中啟到關鍵作用的基因。IGF2 在體內可以促進蛋白質的合成、DNA 的產生及新生血管的形成，同時還具有促進組織生長和分化的能力。IGF-1R 是一個類似胰島素的受體，參與機體內多種過程，包括有絲分裂、細胞存活和分化。IGF2 的非調控表達和IGF-1R 信號網絡的激活與腫瘤干細胞的增殖、存活和自我更新的維持有關。IGF2 可以通過激活IGF 信號通路，導致STAT3 磷酸化，激活下游靶因子，從而進一步達到促進腫瘤發生和發展的作用[33]。EIF4E 是蛋白質翻譯的主要控制點，是真核起始因子4F（eukaryotic translation initiation factor 4F，EIF4F）復合物的一部分。當EIF4E 的翻譯信號激活時就會促進腫瘤的發生[34]。CREB1 在人體中是一種重要的原癌基因，在不同信號通路與下游靶基因轉錄之間起中介作用。同時在cAMP/PKA 通路中，激活的CREB1 可以與啟動因子上保守的cAMP 反應元件結合，在機體內發揮著促進細胞增殖分化和促進腫瘤的轉移和發生的作用[35]。IGF-1R 及其下游轉錄因子STAT3/CREB1 信號的結構性和異常激活在腫瘤轉移過程中起著至關重要的作用，活化的STAT3/CREB1 可能移位到細胞核內，調節侵襲相關靶基因和血管生成基因的表達，參與基底膜和細胞外基質的降解，促進癌細胞的轉移和血管生成。因此猜測檸檬苦素可能通過抑制IGF2/IGFR1 介導的STAT3 信號通路的活性以及下調CREB1/EIF4E 相應靶基因的激活從而達到抗腫瘤轉移的作用，本課題組將進一步進行深入探究。

本研究中，利用多種生物信息學方法多角度考察了對照組和經不同濃度檸檬苦素處理的實驗組在基因表達及生物學過程之間的差異。從基因層面探索了檸檬苦素抑制乳腺癌轉移的潛在靶點及通路，為抗腫瘤轉移的治療提供更好的方向。

綜上所述，檸檬苦素及其結構衍生物可能是一類具有潛在低毒性的抗癌藥物，其機制可能是部分通過IGF2/IGFR1 介導的STAT3 信號傳導途徑實現。