基于鐵死亡基因喉癌預后預測模型的構建

孫娟，楊莉娜 ，崔昊晶，胡文良，蘇琳，2

1內蒙古醫科大學附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，呼和浩特010000；2內蒙古醫科大學研究生學院

喉癌作為頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人們健康。目前，喉癌的診療取得了一定進展，但尚未獲得令人滿意的診療策略，多數患者確診時已為中晚期，總體預后較差。喉癌預后預測仍是臨床一大難題。因此，尋找能夠預測患者預后的分子標志物和治療新靶標意義重大。鐵死亡是近年來新發現的細胞程序性死亡的一種方式，逐漸成為腫瘤領域研究的熱點。研究表明，鐵死亡具有抑制腫瘤（胰腺癌、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤）細胞增殖，增加化療藥物敏感性等作用［1-4］。此外，鐵死亡與頭頸部鱗狀細胞關系密切，抑制Glutaredoxin5基因表達能夠使順鉑耐藥的頭頸部鱗癌細胞發生鐵死亡［4］。可見鐵死亡基因在頭頸部腫瘤發生發展中發揮重要作用。但迄今尚無獨立研究喉癌與鐵死亡基因關系的文獻報道。本研究基于美國癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫，通過生物信息學方法篩選與喉癌預后相關的鐵死亡基因，并建立預后預測模型，以期為喉癌的診療及預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取TCGA數據庫中2000—2020年收錄并具有完整隨訪信息的喉鱗狀細胞癌樣本96例，均來自術后喉鱗狀細胞癌患者，均經病理檢查確診。納入標準：術前未進行放療或化療；首次進行手術治療；隨訪時間均超過1年；病歷資料完整。患者男82例，女14例；年齡≤65歲65例，＞65歲31例；腫瘤等級G1～G2級40例，G3～G4級56例；腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期51例；原發腫瘤浸潤T1～T2期17例，T3～T4期79例；淋巴結轉移N0期41例，N1～N3期55例。下載該喉癌數據集相關轉錄組測序RNAseq數據及樣本相關臨床數據，用于后續分析。本研究經內蒙古醫科大學附屬醫院倫理委員會批準（2017MS0838）。

1.2 喉癌中鐵死亡基因篩選 基于美國國家生物信息中心數據庫挖掘能夠調控腫瘤發生發展的鐵死亡基因60個，用于后續對照分析。用R語言limma包提取96例喉癌樣本中鐵死亡基因，并進行差異表達分析，錯誤發現率檢驗（FDR）＜0.05為基因差異表達。

1.3 與喉癌預后有關的鐵死亡基因篩選 用R語言limma包提取TCGA喉癌樣本的存活時間及存活狀態（96例患者存活60例，死亡36例，隨訪時間2000—2020年），用R語言survival包對基因與喉癌預后時間的關系進行COX單因素回歸分析，P＜0.05被認為與預后相關，風險比（HR）＞1代表該基因表達量與預后呈負相關，即基因表達量越高，預后越差；HR＜1則相反。將差異表達鐵死亡基因與預后相關基因取交集后，獲得與預后相關的鐵死亡基因。同時繪制森林圖，HR＞1為高風險基因，HR＜1為保護基因。用R語言pheatmap包繪制預后相關鐵死亡基因表達熱圖。

1.4 喉癌中鐵死亡基因相關風險模型建立及效能評估 基于LIANG等［5］的研究方法，利用LASSO回歸對TCGA樣本進行風險評分，風險值根據以下公式得出：風險值表示回歸系數，xi表示基因相對表達值。獨立變量是鐵死亡相關預后基因的標準化表達矩陣，而響應變量是TCGA隊列中患者的總體生存率和生存狀態。確定模型的懲罰參數（λ）并遵循最低標準（即對應于最低的部分似然偏差的λ值）進行10倍交叉驗證。根據每個基因的標準化表達水平及其相應的回歸系數計算患者的風險評分。用這3個鐵死亡基因的表達量進行LASSO回歸分析，在模擬1 000次運算后，計算出基于每個獨立基因，或每兩個基因，或全部3個基因的分組結果，結果顯示根據HSPB1、FTH1基因的風險評分中位數（-2.568分）得到的分組結果最優。基于R語言survival包進行鐵死亡基因聯合預測喉癌患者生存率。利用R語言survival ROC包建立時間依賴性的ROC曲線以評估鐵死亡基因相關風險模型對喉癌預后的預測價值。

2 結果

2.1 喉癌中與喉癌預后相關的鐵死亡基因 共篩選出3個鐵死亡基因與喉癌預后相關。PHKG2（HR=0.409，95%CI：0.199～0.842，P=0.015）、HSPB1（HR=1.842，95%CI：1.022～3.320，P=0.042）、FTH1（HR=1.708，95%CI：1.131～2.580，P=0.011）。其中，HSPB1、FTH1為高風險基因，PHKG2為保護基因。與正常樣本對比，PHKG2在喉癌樣本中低表達，HSPB1、FTH1在喉癌樣本中高表達。

2.2 鐵死亡基因風險模型對喉癌預后的預測價值 該模型預測喉癌患者術后1、2、3年生存率的ROC線下面積分別為0.657、0.691、0.770。且隨時間延長，該模型的敏感度、特異度逐漸升高。

3 討論

研究認為細胞死亡主要分為凋亡和壞死。隨著研究不斷深入，細胞還可通過自噬、脹亡、焦亡等方式死亡［6-7］。此外，鐵死亡是2012年發現的一種鐵依賴的細胞程序性死亡形式之一，涉及多種疾病，有望成為腫瘤治療的新方式［8］。研究發現，細胞鐵死亡過程會受復雜的基因網絡調控，如核因子E2相關因子2能夠通過調控鐵死亡和線粒體功能障礙參與神經變性過程［9］。腫瘤抑制因子TP53可通過抑制溶質載體家族7成員11或過表達亞精胺/亞精胺N1-乙酰轉移酶1、谷氨酰胺酶2，影響鐵死亡基因網絡，從而促進細胞鐵死亡［10］。

本研究通過文獻挖掘收集了與鐵死亡相關的基因60個，并以此為靶點進行分析。本研究共發現喉癌預后相關鐵死亡基因3個，分別為兩個高危基因PHKG2、FTH1，1個保護基因HSPB1。研究發現，抑制谷胱甘肽過氧化物酶4的小分子會引起脂質過氧化物的致死性積累，并導致鐵死亡。在這個過程中，PHKG2能夠調節脂氧合酶的鐵利用量，進而使不飽和脂肪酸發生氧化，從而驅動鐵死亡［11］。PHKG2在喉癌中的作用尚不清楚。本研究發現PHKG2高表達是喉癌預后的高危因素，這可能與PHKG2通過調節鐵死亡通路來促進喉癌發生發展有關。研究證實，FTH1能夠通過吞噬鐵蛋白來抑制鐵死亡的發生，這使得FTH1能夠抑制鐵死亡促進多種癌癥（肝癌、膀胱癌等）的發生發展［12-13］，但FTH1在喉癌中的作用還不清楚。本研究發現，FTH1是喉癌預后的高危因素，提示FTH1可能在喉癌中也具有促癌作用。HSPB1是癌細胞鐵死亡的負性調節劑。蛋白激酶C介導的HSPB1磷酸化可通過減少鐵介導的脂質反應性氧化而抑制鐵死亡，從而提高抗癌活性［14］。在裸鼠成瘤實驗中過表達HSPB1后，癌細胞的鐵死亡明顯增強。本研究發現，HSPB1是喉癌預后的保護因素。以上結果提示HSPB1、PHKG2、FTH1能夠通過調控鐵死亡過程影響癌癥的發生發展，然而它們在喉癌中的作用尚不清楚。本研究發現它們與喉癌的預后關系密切，可能是喉癌發生發展的重要調控因子。

目前，臨床主要根據腫瘤組織病理、淋巴結活檢及遠處轉移來預測喉癌患者的預后。然而，以上預測也存在較大差異，需要補充其他輔助手段進而提高預測準確性［15］。本研究通過LASSO回歸等方法建立喉癌預后預測模型，以期為喉癌患者的預后預測找尋新的靶點。該模型基于鐵死亡基因HSPB1和FTH1的表達將喉癌患者分為高風險組和低風險組，生存曲線證實兩組生存率有顯著差異，survStat分析結果也佐證了這一結果。ROC曲線提示該模型隨生存時間延長其敏感度和特異度隨之升高。這提示該模型具有較強的預后預測能力。然而，該模型對喉癌患者的危險評分能夠與腫瘤分期作用相當，提示該模型具有重要的臨床價值。在未來，臨床中可能通過檢測喉癌患者樣本中HSPB1和FTH1的表達量，來判斷喉癌患者是否處于高風險組，從而達到預測預后的目的。此外，與其他研究［16］相比，本研究的創新點在于將研究范圍精準縮小，重點探索鐵死亡基因對喉癌預后的判斷及影響，有助于喉癌發生新機制以及喉癌預后預測等方面的深入研究。這是首個根據鐵死亡基因建立的喉癌預后預測模型。結果顯示，這一模型能夠準確區分高危風險與低危風險喉癌患者，而且具有很高的敏感度和特異度，具有成為輔助預后預測靶點的潛力。此外，在獨立危險因素分析中，喉癌的腫瘤分期是獨立危險因素之一，這符合惡性腫瘤的性質特點。與腫瘤分期相比，本研究中的預測模型同樣能夠作為喉癌預后獨立危險因素。盡管得出上述結論，但有關這3個鐵死亡基因在喉癌中的作用及機制的臨床、基礎研究很少，仍需進一步研究證實三者在喉癌中的作用。

綜上所述，基于TCGA和生物信息學方法構建喉癌預后預測模型，結果顯示HSPB1是喉癌預后的保護因素，PHKG2和FTH1是喉癌預后的高危因素。該模型具有較高的敏感度和特異度，可能為喉癌的診療及預后評估提供新的切入點。