趨化因子CCL15調控肝臟腫瘤微環境的作用機制研究進展

崔冉亮，任麗，李悅國

天津醫科大學腫瘤醫院檢驗科國家腫瘤臨床醫學研究中心天津市“腫瘤防治”重點實驗室天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津300060

肝細胞癌（HCC）占原發性肝癌的90%，是全球范圍內癌癥相關死亡的主要原因之一。在生理條件下，因進食等因素，肝臟經常受到來自腸源性抗原的刺激，形成免疫耐受，使肝臟具有復雜的微環境。同時，HCC患者常伴有乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染，在多種細胞和多種因子相互作用下，形成更為復雜的微環境。肝臟中腫瘤細胞生長存活所處的這種復雜生理環境被稱為肝臟腫瘤微環境。與HCC有關的腫瘤微環境由多種成分組成，如肝癌細胞、免疫細胞、肝星狀細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、內皮細胞、間質干細胞等細胞組分，以及細胞外基質、炎癥因子、生長因子等非細胞組分［1］。HCC是一種典型的炎癥相關性腫瘤，慢性炎癥反應在HCC發生發展的各個階段都發揮著關鍵作用。炎癥的持續存在形成一種適合腫瘤存活的腫瘤微環境，有利于HCC的發生；異常分泌細胞因子（如生長因子、細胞因子和趨化因子）以及招募炎癥細胞到腫瘤部位是腫瘤相關慢性炎癥的主要特征［2］。趨化因子是一種小型分泌性蛋白，可招募免疫細胞直接遷移到腫瘤組織，并作為促炎癥介質調節腫瘤微環境，促進血管生成，誘導腫瘤遷移以加速腫瘤的發展、侵襲和轉移［3］。CCL15是HCC細胞系和組織中表達最豐富的趨化因子，是HCC極具潛力的生物標志物及治療靶點。CCL15通過激活其受體CCR1，誘導免疫細胞遷移、血管生成及上皮間質轉化（EMT）［4-6］，影響肝臟腫瘤微環境并促進HCC的浸潤及轉移。已有研究證實，CCL15是HCC生存的獨立預測指標，其表達量越高，患者預后越差［7］。因此，了解CCL15參與HCC發生發展的分子機制，對發現新的治療方法以及改善患者預后至關重要。現就CCL15調控肝臟腫瘤微環境的作用機制綜述如下。

1 CCL15對肝臟腫瘤微環境免疫功能的調控作用

CCL15可作為不同類型細胞的螯合劑，招募單核細胞、腫瘤相關巨噬細胞（TAM）、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞、樹狀突細胞等免疫細胞以及骨髓源性抑制細胞（MDSC）進入腫瘤，這些細胞共同作用于HCC的肝臟腫瘤微環境，造成免疫抑制，促進腫瘤進展。

1.1 CCL15對CCR1+CD14+單核細胞的影響CCL15可特異性招募CCR1+細胞到HCC侵襲邊緣，其中約80%為CD14+單核細胞，經腫瘤浸潤的CCR1+CD14+單核細胞中，PD-L1、B7-H3、TIM-3、IDO表達水平明顯升高［6］。PD-L1是PD-1的主要配體，可誘導T淋巴細胞失活、凋亡，保護腫瘤細胞免受CD8+T淋巴細胞的殺傷［8］；B7-H3可直接抑制CD8+T淋巴細胞和NK細胞激活［9］；TIM-3是一種可抑制CTL和效應性Th1細胞功能的抑制性受體［10］；IDO可直接抑制效應性T淋巴細胞的增殖和分化，并增強調節性T淋巴細胞的抑制活性［11］。上述影響共同促成了機體免疫系統無法對腫瘤抗原做出有效應答，形成免疫逃避。PARK等［12］報道，在缺氧條件下，通過上調CCL15，可引起ICAM-1高表達，導致單核細胞對內皮細胞的黏附性增加。這表明HCC中持續存在的缺氧微環境可促使CCL15對單核細胞的招募增加，從而抑制腫瘤免疫。

1.2 CCL15對TAM的影響TAM是先天免疫系統的主要組成部分，可引起或促進HCC的發生、侵襲和轉移，并刺激血管生成。它可產生細胞因子、趨化因子、生長因子，并觸發T淋巴細胞釋放抑制性免疫檢查點蛋白［13］，是創造免疫抑制性腫瘤微環境的關鍵細胞。TAM可發生“巨噬細胞極化”，即分化為具有抑瘤活性的M1型和具有促瘤活性的M2型［14］。HCC腫瘤微環境中的TAM大多為極化的M2表型，癌細胞衍生的Wnt配體通過Wnt/β-catenin信號通路刺激TAM的M2樣極化，從而導致HCC的生長、遷移和免疫抑制［15］。PPIA可能通過調控mRNA代謝過程和腫瘤免疫來參與HCC的發展［16］。研究表明，HCC中CCL15表 達 與PPIA表 達的 變化 一致，PPI?AP22/miR-197-3p/PPIA通路可通過CCL15-CCR1軸增加腫瘤細胞的惡性程度，并招募單核細胞來調節HCC腫瘤微環境中巨噬細胞浸潤，最終引起HCC進展［17］。

1.3 CCL15對MDSC的影響MDSC是腫瘤微環境的主要組成部分之一，血清和腫瘤組織中CCL15水平升高可導致CCR1+MDSC在腫瘤組織中積累［18］。與存在于外周淋巴器官的MDSC相比，存在于腫瘤微環境內的單核細胞樣骨髓源性抑制細胞（M-MDSC）和分葉核樣骨髓源性抑制細胞（PMN-MDSC）對機體免疫功能具有更強的抑制作用［19］。M-MDSC的組蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）與視網膜母細胞瘤蛋白（Rb1）啟動子區域結合，導致Rb1在腫瘤微環境中下調表達，最終從PMN-MDSC獲得表型、形態和功能特征［20］。腫瘤微環境中的MDSC可以通過一定條件抑制效應T淋巴細胞，誘導調節性T淋巴細胞或調節性B淋巴細胞擴增，同時也可以抑制NK細胞的殺傷功能以及DC的抗原提呈功能，來負向調控免疫功能，促進腫瘤生長［21-23］。此外，M-MDSC還可以迅速分化為TAM［24］，促使機體進一步形成免疫耐受的微環境。以上研究表明，HCC患者CCL15高表達可導致MDSC在HCC組織中累積，并通過一系列作用抑制機體免疫功能，使腫瘤細胞躲避機體的監視和攻擊，形成有利于腫瘤生存的免疫耐受的微環境。

1.4 CCL15對腫瘤微環境中其他免疫相關細胞的影響有學者研究了CCL15具有不同氨基末端長度的三種分子形式：27-92、25-92和1-92，以確定其生物活性。其中CCL15（27-92）作為單核細胞有效的螯合劑，能吸引嗜酸性粒細胞；CCL15（25-92）對新鮮分離的單核細胞、樹突狀細胞（DC）和T淋巴細胞有明顯的趨化活性，但對嗜酸性粒細胞有中等程度的趨化作用，而且不能動員多形核白細胞（PMN）；CCL15（1-92）可誘導新鮮分離的單核細胞和T淋巴細胞的趨化，這與CCL15（25-92）和（27-92）相似［21］。DC表達的PD-L1與活化T淋巴細胞表達的PD-1結合可抑制T淋巴細胞增殖和細胞因子的產生；DC還可以通過表達T淋巴細胞激活可變區結構域免疫球蛋白抑制物來抑制T淋巴細胞抗腫瘤免疫作用［22］。浸潤到腫瘤微環境中的中性粒細胞被稱為腫瘤相關中性粒細胞（TAN），根據腫瘤微環境中不同的刺激因素可極化為N1、N2兩種亞型，其中N2型中性粒細胞主要通過釋放胞外誘捕網、抑制免疫反應，以及產生細胞因子、蛋白酶等衍生物來促進腫瘤進展［23］。嗜酸性粒細胞儲存了大量IL-4、IL-13，可以指導體內巨噬細胞的極化，其中IL-4在肝臟和肌肉再生中發揮關鍵功能，嗜酸細胞可通過促進免疫抑制性TAM表型來抑制微環境中的抗腫瘤免疫［24］。因此，CCL15介導腫瘤微環境中的多種免疫細胞的相互作用，共同創造了一個免疫抑制性腫瘤微環境，促進HCC的發展。

2 CCL15對肝臟腫瘤微環境血管生成活性的調控作用

HCC是一種典型的血管生成性腫瘤，其生長依賴于氧氣和營養物質的充足供應，其中血管網生成具有重要作用，血管生成失調與癌癥的發展和轉移密切相關。CCL15可通過多種途徑促進血管生成，增加HCC腫瘤微環境中的氧氣和營養物質的含量，從而促進HCC的生長及轉移。

2.1 CCL15對血管生成的影響除了具有白細胞招募和趨化方面的功能之外，越來越多的證據表明，CCL15可調節血管生成。研究表明，CCL15可通過CCR1刺激趨化性內皮細胞遷移和分化，具有體外和體內血管生成的活性，其中CCL15（25-92）比完整形式的CCL15對內皮細胞具有更強的趨化活性［25］。同時CCL15可招募MDSC進入腫瘤，而MDSC通過在腫瘤微環境中分泌生長因子如血管內皮生長因子（VEGF）、堿性生長因子、Bv8和血小板源生長因子，并通過產生基質金屬蛋白酶9提高腫瘤微環境中VEGF的生物利用率，從而促進新血管生成［26］。此外，MDSCs還能夠促進腫瘤微環境中的TAM、中性粒細胞、T淋巴細胞分化為促進腫瘤的Tie2+TAM、TAN和Treg表型，分泌VEGF以促進血管生成［27］。

2.2 CCL15對造血祖細胞的影響人血漿中分離出的CCL15可被中性粒細胞組織蛋白酶G和彈性蛋白酶進行N端加工和激活，生成低分子量的CCL15（27-92），調節造血祖細胞的遷移和黏附特性，改善造血祖細胞再生的能力［28］。此外，中性粒細胞絲氨酸蛋白酶對CCL15的水解激活可能導致CXCL12引導的遷移能力增強，以及造血祖細胞對內皮配體如VCAM-1的黏附能力增強，這都是參與造血祖細胞動員調節的中心環節［28］。在實體腫瘤中，造血祖細胞有免疫抑制作用，且HSPCs可用于緊急造血，在炎癥條件下重建和血液系統［29］，大大增加了腫瘤微環境中的氧氣和營養物質的含量，從多方面促進腫瘤發展。

3 CCL15通過EMT對肝臟腫瘤微環境的調控作用

EMT是上皮細胞轉化為間質細胞的生理過程，這一過程意味著細胞內黏附力改變，使頂端—基底細胞喪失極性，腫瘤獲得侵襲性和轉移的能力，尤其是包括HCC在內的上皮細胞來源性腫瘤。發生EMT的腫瘤細胞可分泌大量炎癥介質，改變肝臟腫瘤微環境中的細胞和非細胞成分，參與腫瘤細胞與腫瘤微環境的相互作用。

3.1 CCL15對間充質干細胞（MSC）的影響MSC是在大多數癌癥中發現的多能基質干細胞，對腫瘤微環境的形成和功能起著關鍵的影響作用。雖然人類MSC不會發展為腫瘤，但其可分化為其他促腫瘤性基質成分，抑制免疫反應，促進血管生成，增強EMT來促進腫瘤的生長和轉移。由于CCL15可招募MSC進入腫瘤［30］，因此推測，CCL15可能通過對MSC的趨化作用調節MSC的活動并重塑細胞外基質成分，改變腫瘤微環境，引起EMT以促進HCC的轉移。

3.2 CCL15對免疫檢查點分子的影響除了在胚胎發育和組織纖維化中的典型作用外，EMT在腫瘤免疫抑制和免疫規避中也起著關鍵的作用。EMT與不同免疫檢查點分子的激活有關，包括TIM-3和PD-L1。由于CCL15特異性招募的CCR1+CD14+單核細胞可使TIM-3、PD-L1表達水平明顯升高［6］，其中TIM-3具有促進腫瘤細胞遷移和侵襲的能力，在HCC的轉移中起著重要作用，是EMT的潛在誘導劑［31］；PD-L1在維持的EMT狀態中起著重要作用，而EMT過程又可上調PD-L1表達，PD-L1和EMT之間的雙向調節在腫瘤免疫逃逸中起關鍵作用［32］。因此在HCC進程中，CCL15過表達能夠激活EMT形成的相關通路，或增加誘導EMT形成的相關因子表達，促使腫瘤細胞發生EMT，改變HCC腫瘤微環境，從而造成免疫逃逸并加速腫瘤轉移。

4 CCL15與乙肝病毒X蛋白（HBX）在肝臟腫瘤微環境中的協同作用

研究顯示，在由HBV引發的肝細胞癌中，CCL15表 達 與 血 清HBX水 平 呈 明 顯 正 相 關［33］。HBX與CCL15協同作用于HCC的腫瘤微環境，激活相同的致癌通路與細胞因子，共同造成機體免疫逃避，促進HCC的侵襲、轉移。

4.1 CCL15與HBX對腫瘤微環境中腫瘤壞死因子α（TNF-α）的影響HBX蛋白可能通過增加內源性PKC活化子1，2-二酰基甘油，激活NF-κB，上調巨噬細胞分泌TNF-α［33］；或激活ERK通路，使AP-1活化并進入核內，再與AP-1結合位點結合，啟動TNF-α基因轉錄［34］。因TNF-α可促進HCC中活化的CCR1+CD14+單核細胞生成CCL15，而CCL15又可激活ERK、NF-κB信號通路［6］，因此HBX與CCL15可形成一種相互促進的信號環路，來增加腫瘤微環境中TNF-α表達。TNF-α能夠通過瞬時受體電位通道促使Ca2+從細胞外流入細胞內，從而激活鈣蛋白酶/IAP/Caspase-3信號通路促進HCC細胞凋亡［35］。但也有證據表明，TNF-α是炎癥的核心介質，在慢性炎癥向惡性腫瘤發展的過程中提供分子聯系，其在HCC組織中的表達明顯高于正常肝臟組織，并可促進HCC的侵襲和轉移［36］；進一步研究顯示，CCL15表達與患者的預后呈負相關，具有促HCC發展的作用。綜上所述，CCL15與HBX協同促進TNF-α表達對HCC腫瘤微環境的影響還有待進一步探討。

4.2 CCL15與HBX對腫瘤微環境中信號通路的影響HBX可以激活AKT途徑從而抑制肝細胞的凋亡，促進HBV的持續復制以及肝癌的發展［37］，且HBX可能通過活化NF-κB、JAK/STAT信號通路中的某些核心因子上調肝癌細胞中PD-L1的表達［38］。研究表明，CCL15能夠激活腫瘤微環境中的AKT、NF-κB、STAT信 號 通 路，且 由CCL15所 招 募 的CCR1+CD14+單核細胞中，PD-L1表達水平明顯升高［6］。因此CCL15與HBX協同作用于HCC腫瘤微環境，共同促進乙肝病毒的復制，并通過高度上調PD-L1表達，使微環境中的免疫功能受到抑制，進一步加強HBV的復制能力，造成腫瘤的侵襲與發展。

綜上所述，趨化因子CCL15在HCC患者肝臟組織中高表達，且在HCC侵襲和轉移過程中具有促進作用。CCL15過表達能夠通過招募多種白細胞造成HCC的免疫抑制、促進血管生成、誘導發生EMT，同時還與HBX協同作用，共同影響HCC腫瘤微環境，促進腫瘤進展。現有的研究對CCL15在HCC發生發展過程中作用于腫瘤微環境的機制有了初步了解，為臨床HCC的治療提供了新方向。未來CCL15有望作為HCC的血清檢查標志物以及臨床診斷和治療HCC的新靶點，為更多的HCC患者帶來希望。