224例單核苷酸多態微陣列芯片檢出拷貝數變異胎兒的產前診斷結果

許玲 王挺 黎鳳珍 盧建 張暢斌 黃華梅

(廣東省婦幼保健院 醫學遺傳中心，廣東 廣州 511442)

近年來，染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)技術被越來越多地應用于產前診斷中。CMA技術相比于傳統的核型分析，可以提高染色體異常的檢出率，甚至可作為超聲檢查異常胎兒的首選產前診斷方法[1，2]。CMA主要包括微陣列比較基因組雜交以及單核苷酸多態性微陣列(single nucleotide polymorphism-array，SNP-array)技術。SNP-array的技術原理是將大量單核苷酸多態性序列位點用特殊方法固定在芯片上，獲得高密度的SNP-array，然后與樣品雜交，再通過激光掃描及軟件分析獲得結果[3]。相較于微陣列比較基因組雜交，SNP-array技術不僅可檢出微小的染色體異常，還可以檢出單親二倍體、三倍體和高比例嵌合體[4]。本研究通過分析224例核型分析未見異常但SNP-array檢出拷貝數變異(copy number variations，CNVs)的產前診斷病例，統計其超聲檢查結果，隨訪妊娠結局，探討SNP-array技術在產前診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2015年1月至2017年12月在廣東省婦幼保健院醫學遺傳中心就診的224例核型分析未見異常但SNP-array檢出CNVs的單胎妊娠孕婦。224例孕婦的產前診斷指征為不良生育史、高齡妊娠、無創產前檢測高風險以及超聲檢查結果異常，如胎兒頸項透明層(nuchal translucency,NT)增厚、腎臟異常、側腦室增寬、心臟異常、鼻骨缺如及胎兒生長受限(fetal growth restriction，FGR)等。

1.2 SNP-array檢測 ①DNA提?。喝?0ml羊水或1ml臍靜脈血，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒(美國Qiagen公司)進行DNA提取，并用NANODROP 2000分光光度計測定DNA濃度是否達標。②SNP-array檢測：取DNA樣本應用Affymatrix公司的CytoScan 750K芯片進行檢測，包括酶切、連接、聚合酶鏈反應擴增、純化、片段化、標記、雜交洗滌、掃描和分析等步驟，所得結果用ChAS3.1.0.15軟件進行分析。所得CNVs結果，參照DGV(http://projects.tcag.ca/variation)、DECIPHER(http://decipher.sanger.ac.uk/)、PubMed(www.ncbi.nim.nih.gov/pubmed/)、在線人類孟德爾遺傳(www.ncbi.nim.nih.gov/omim)等數據庫進行分析。③結果判讀：參照文獻[5]，將CNVs分為致病性CNVs、良性CNVs、可能致病CNVs、意義不明確的CNVs(variants of unknown significance,VOUS)及雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)。

1.3 隨訪 對所有病例進行電話隨訪，追蹤妊娠結局及新生兒生長發育情況。

2 結果

2.1 超聲資料 224例孕婦年齡為(30.1±5.3)歲，范圍為18～45歲；羊膜腔穿刺或臍靜脈穿刺取樣時的孕周為(24.6±5.3)周，范圍為17～38周；超聲顯示的異常主要是胎兒側腦室增寬和NT增厚。見表1。

2.2 SNP-array檢測結果 VOUS占34.8%(78/224)，致病性CNVs占33.0%(74/224)，LOH占17.0%(38/224)，可能致病CNVs占12.9%(29/224)，良性CNVs占2.2%(5/224)。5例致病性CNVs異常涉及2條染色體，占6.8%(5/74)。見表2。

表1 224例胎兒超聲檢查情況及其構成比

表2 224例胎兒的CNVs分類、超聲表現及妊娠結局

2.3 超聲未見異常病例CNVs類型分布 84例超聲檢查未見異常者的產前診斷指征包括無創產前檢測高風險、不良生育史和高齡妊娠等，檢出的致病性CNVs占23.8%(20/84)，VOUS占34.5%(29/84)，可能致病CNVs占10.7%(9/84)，LOH占25.0%(21/84)，良性CNVs占6.0%(5/84)。

2.4 致病性CNVs 共檢出74例致病性CNVs，以17、X和16號染色體受累最多，見表3。

表3 74例致病性CNVs的受累染色體分布及其構成比

2.5 LOH病例 共檢出38例LOH，片段大小為1.49～50Mb，產前診斷指征多樣，最多見無創產前檢測高風險，見表4。

表4 38例LOH病例的產前診斷指征及其構成比

2.6 多重CNVs異常病例 74例致病性CNVs中有5例涉及2條染色體異常，占6.7%(5/74)，其中1例是4號和6號染色體重復，另外4例是部分單體和部分三體。見表5。

2.7 隨訪結果 224例孕婦中，79例終止妊娠，94例活產分娩，51例失訪。79例終止妊娠孕婦中有2例于臍靜脈穿刺術后胎死宮內，其中1例檢出致病性CNVs (11p15.5重復 0.74 Mb)， 超聲提示雙腎增大、羊水過多；另1例超聲提示羊水過少，CNVs為VOUS(22q13.2重復1.5 Mb)。還有1例于羊膜腔穿刺術后胎死宮內，超聲提示NT增厚(3.0 mm)，檢出致病性CNVs(22q11.21重復3.15 Mb)。

表5 5例多重CNVs異常孕婦臨床資料

94例活產分娩孕婦中1例新生兒生后聽力篩查提示耳聾，SNP-array檢出致病性CNVs(17q12缺失1.6 Mb)，1例新生兒產前超聲提示為淋巴管瘤，SNP-array檢出良性CNVs(4q13.3重復1.1 Mb)，隨訪到2歲暫未見異常；3例新生兒于產前超聲發現膈疝，CNVs均為良性變異，出生后接受治療，隨訪至2歲暫未見異常。

3 討論

SNP-array技術在檢測染色體亞微觀結構上具有傳統核型分析難以比擬的優勢，對超聲異常病例的染色體結構異常的檢出率高于傳統的核型分析，且有取代傳統核型分析成為超聲異常患者的首選檢查技術的趨勢[6-9]。然而，關于超聲表現和CNVs的相關性及最終妊娠結局的大樣本研究較少。本研究選擇224例核型分析未見異常但SNP-array檢出CNVs的孕婦，回顧性分析超聲表現與CNVs的關系，探討SNP-array在產前診斷中的價值。

3.1 CNVs的分類及超聲表現 在檢出CNVs的224例孕婦中，主要的超聲異常是胎兒側腦室增寬和NT增厚。研究顯示，胎兒側腦室增寬是早孕期超聲篩查中最常見的顱腦異常，發生率為1.5‰～2.2‰，大多數輕度側腦室增寬可于中孕期消失，而重度側腦室增寬則常伴有其他異常且預后不良[10]。NT增厚與唐氏綜合征、水腫等胎兒異常密切相關，是早孕期超聲篩查最常見的異常指標[11]。遺傳咨詢中，這2類產前診斷指征者推薦將CMA作為一線檢測方法。

本研究224例CNVs病例中，VOUS占34.8%(78/224)，致病性CNVs占33.0%(74/224)，LOH占17.0%(38/224)，可能致病CNVs占12.9%(29/224)，良性CNVs占2.2%(5/224)。國內一項研究對208例超聲異常孕婦行SNP-array檢測，檢出29例CNVs，其中致病性CNVs18例，占62.1%(18/29)[12]，高于本研究，可能與本研究包含了超聲未見異常的病例以及不同基因芯片平臺的CNVs報告標準不同有關。

3.2 致病性CNVs的超聲表現及妊娠結局 本研究74例致病性CNVs中，以17、X和16號染色體受累最多。人類17號染色體由8100萬個堿基對組成，包含1500多個基因，基因密度在人類染色體中排第二，包含與Miller-Dieker綜合征、乳腺癌、神經纖維瘤等多種疾病相關的基因。本研究檢出的14例17號染色體致病性CNVs中，有2例Miller-Dieker綜合征(17p13.3缺失)，7例17q12微缺失綜合征，5例致病性CNVs位于17p12(3例重復、2例缺失)。2例Miller-Dieker綜合征胎兒超聲均提示側腦室增寬，孕婦選擇終止妊娠。7例17q12微缺失綜合征胎兒中6例超聲顯示不同程度的腎臟異常，1例超聲發現顱骨光環欠規則且后顱窩池近消失。17q12區域包含HNF1B等20個基因，該區域缺失與腎囊腫和糖尿病綜合征相關，相關表型主要包括泌尿生殖系統異常(尤其是腎囊腫、腎小球囊性病變和腎發育不良)、糖尿病、孤獨癥譜系神經認知障礙。17q12缺失的外顯率為34.4%[13]。本研究7例17q12微缺失綜合征胎兒中，4例終止妊娠，2例失訪，1例活產分娩；該活產新生兒出生體重3900g，隨訪至1歲半，家屬反映除聽力發育較差，其他無異常。5例胎兒17p12致病性CNVs的孕婦，3例選擇終止妊娠，1例失訪，另外1例17p12重復的孕婦于39周活產分娩，嬰兒隨訪至1歲3個月未發現異常。

本研究中檢出5例多重致病性CNVs，其中1例為4號和6號染色體部分重復，另外4例來自親代隱匿性易位后產生的部分三體部分單體，因易位后的片段大小低于人眼的分辨率，故核型分析報告為46,XY或者46,XX。傳統的光學顯微鏡最小可檢測到3Mb的染色體片段異常，然而由于各實驗室G顯帶制片水平的差異，分析人員對高分辨染色體帶紋敏感性不同，以及易位發生的位置等因素，實際上5～10Mb范圍內的片段異常在核型分析過程中極易被漏診[14]。本研究通過SNP-array技術，在核型分析未見異常的產前診斷病例中發現了4例親代存在隱匿性平衡易位，這類平衡易位在傳統的染色體G顯帶分析技術中，由于易位片段小和易位后異常染色體變化不明顯，因此建議親代行高分辨染色體G顯帶分析。而且，解讀核型報告時要謹慎，如異常片段低于5Mb時，核型報告為46,XY或者46,XX，并去掉未見異常核型的后綴。該5例病例中有4例選擇終止妊娠，另1例于孕39周陰道分娩一3800 g男嬰，隨訪至1歲2個月，生長發育落后，肌張力低下，語言發育遲緩。

3.3 LOH 本研究共檢出38例LOH，其中3例為致病性LOH，占7.9%(3/38)，涉及6、15和20號染色體，此3條染色體都有單親二倍體致病性報道[15-17]。這3對夫婦雙方行SNP-array驗證，6號染色體LOH為父源性單親二倍體，該單親二倍體可導致新生兒一過性糖尿病，知情同意后孕婦選擇繼續妊娠，于孕30周剖宮產一1900g男嬰，隨訪至2歲，暫未見異常；15號染色體LOH的病例經驗證后提示父源性缺失，確診為Prader-Willi綜合征，家屬知情同意后選擇終止妊娠；20號染色體LOH病例超聲檢查提示胎盤增厚，羊水偏少，但孕婦拒絕進一步驗證和隨訪。

3.4 隨訪 遺傳咨詢工作中，隨訪有著重要的參考意義，但本研究失訪率較高，為22.8%(51/224)，原因是電話信息有誤或者拒絕隨訪。本研究中35例未致病LOH和78例VOUS在目前的數據庫中暫未見有異常病例的報道，不排除隨著數據庫的積累更新后會出現新發病例，對這部分人群的遺傳咨詢應謹慎對待，要充分告知其SNP-array技術的意義和局限性，對有產前診斷指征者，在經濟條件允許的情況下，應建議行SNP-array和細胞遺傳學聯合檢測，以避免漏診。