無創產前基因檢測對血清學篩查臨界風險孕婦的檢測效能

王奕霞 彭海山 李怡 楊潔霞 侯亞萍 郭芳芳 歐陽浩新 王東梅

(廣東省婦幼保健院 醫學遺傳中心，廣東 廣州 511442)

我國每年新增約90萬例出生缺陷兒，染色體異常是導致出生缺陷的最常見因素，最常見的染色體異常主要包括21-三體、18-三體、13-三體和性染色體異常，每年新增的缺陷兒已經成為影響我國人口素質及群體健康水平的公共衛生問題[1,2]。在無創產前基因檢測(noninvasive prenatal testing，NIPT)進入臨床應用之前，預防出生缺陷主要靠血清學篩查和介入性產前診斷等，但血清學的漏診率(20%～40%)和假陽性(5%)很高[3]，而介入性產前診斷雖是金標準但又具有很大的風險(如宮內感染、流產等)，且有部分患者存在一定的禁忌證(發熱、先兆流產、出血傾向以及感染未愈)而不適用。無創產前基因檢測是抽取孕婦外周血檢測游離胎兒DNA的技術，其特點具有快速，無創傷性，安全性高，不會對胎兒和孕婦造成任何風險，且經國內外研究證實具有很高的靈敏度和特異度，可高達99%[4，5]，因此NIPT作為產前篩查的手段受到了廣大孕婦的青睞，特別是對于血清學篩查臨界風險的孕婦來說是一個不錯的選擇，可以有效地降低介入性產前診斷帶來的風險，并提高產前篩查的效能。本研究通過選取12 342例血清學篩查臨界風險的病例，采用高通量基因測序技術分析孕婦外周血胎兒游離DNA，對NIPT提示高風險的孕婦進一步行產前診斷，并對所有納入病例進行妊娠結局隨訪，探討無創產前基因篩查對于血清學篩查臨界風險孕婦的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 基本資料 選取了12 342例于2015年1月至2019年12月就診于廣東省婦幼保健院，血清學篩查臨界風險的單胎孕婦(孕12～38周，年齡15～47歲)，自愿接受NIPT檢測。所有孕婦符合孕期不合并惡性腫瘤、一年內沒有異體輸血、移植手術和細胞治療、夫婦均沒明確的染色體異常。檢測前把適應證、局限性及可能存在的風險告知孕婦，孕婦充分知情同意后簽署知情同意書。NIPT提示高風險的孕婦進一步行產前診斷，并對所有納入研究范圍的孕婦進行隨訪，本研究符合倫理標準并通過醫院醫學倫理委員會的批準。

1.2 檢測方法

1.2.1 早中期血清學篩查 采用PerkinElmer公司DELFLA-1235型全自動時間熒光分辨儀及檢測試劑盒對孕婦外周血進行檢測：①孕早期(9～13+6周)采用血清學標志物(PAPPA+游離β-HCG+NT)評估風險；②孕中期(15～20+6周)采用血清學標志物(AFP+游離β-Hcg+uE3)評估風險。根據血清學篩查結果，并結合孕婦體重、年齡、孕周等因素通過唐氏綜合征風險評估軟件“LifeCycle4.0”評估風險。21-三體的臨界風險值介于1/1000～1/250，18-三體臨界風險值介于 1/1000～1/350。

1.2.2 無創產前基因檢測流程 采集孕婦外周血于EDTA抗凝管或游離核酸采樣管，前者4℃保存，8h內分離血漿，后者放置室溫，3天內分離血漿。①分離后的血漿用tianLong核酸提取儀和磁珠法游離核酸DNA提取試劑盒提取DNA；② Biomek4000全自動化工作站和博奧晶芯測序試劑盒構建文庫、文庫定量等操作，具體操作嚴格按照儀器和試劑盒說明書進行；③將待測文庫混合后在Proton 高通量測序平臺檢測；④測序后，通過序列的比對、拼接等生物信息學處理，對不同染色體水平進行統計，識別胎兒染色體是否有異常，并通過統計學公式得出胎兒患染色體非整倍體或拷貝數變異的風險。

2.3 染色體核型分析和隨訪 NIPT提示高風險的孕婦，充分告知孕婦各種方法的局限性，可能存在的風險，經孕婦知情同意后，抽取羊水或臍血進行染色體核型分析或者染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)檢測。對所有納入標準的孕婦進行電話隨訪或者病例查詢，高風險孕婦隨訪至有妊娠結局出現，低風險孕婦則隨訪至新生兒出生后，隨訪率100%。

2.4 統計學處理 所有計數資料用頻數和頻率表示。無創結果和核型或 CMA 結果比較則通過陽性預測值(positive predictive value，PPV)、靈敏度、特異度、假陽性率進行評估。PPV=真陽性病例數/(真陽性病例+假陽性病例)；靈敏度=真陽性病例數/(真陽性病例數+假陰性病例數)；特異度=真陰性病例數/(真陰性病例數+假陽性病例數)；假陽性率=假陽性病例數/(假陽性病例+真陰性病例)。

3 結果

3.1 不同年齡組的分布情況 本研究血清學臨界風險病例共12 342例，經孕婦知情同意，自行選擇進行NIPT檢測，檢測成功率100%。NIPT提示高風險共74例，陽性率為0.60%(74/12 342)。其中<35歲組檢出56例，檢出率0.56%(56/10 043)；≥35歲組檢出18例，檢出率0.78%(18/2299),具體分布情況見表1。

表1 不同年齡組的分布情況

3.2 NIPT高風險孕婦核型結果分析 74例NIPT高風險孕婦，經知情同意，簽署知情同意書，均進行介入性產前診斷，其中21-三體高風險28例，確診20例，陽性預測值為71.43%；18-三體高風險3例，確診1例，陽性預測值為 33.33%；13-三體高風險10例，確診4例，陽性預測值40.00%。性染色體異常22例，確診5例，陽性預測22.73%。缺失/重復共11例，確診4例，陽性預測值36.36%。高風險結果以21-三體高風險占較大，占37.84%(28/74)，NIPT檢測結果低風險孕婦通過電話或者病例查詢隨訪至新生兒出生，均未發現陽性結果。NIPT對血清學臨界風險孕婦的檢測效能見表2。

表2 NIPT對血清學臨界風險的檢測效能

4 討論

隨著經濟發展醫療教育水平的提高,人們對于預防出生缺陷，優生優育的意識也越來越強。常見的21-三體、18-三體、13-三體染色體非整倍體是導致新生兒出生缺陷的重要原因之一[1]。而目前臨床上缺乏有效治療手段，需要及時通過產前篩查和產前診斷的檢測，避免缺陷兒的出生。

隨著技術的發展革新,基于胎兒游離DNA的高通量測序技術因其是一種無創、快捷、安全有效的篩查方法而倍受孕婦關注。經過近十年的數據積累，國際上對NIPT檢測 21-三體、18-三體及 13-三體綜合征的準確性和特異性在臨床應用中的價值已獲得高度認可[6，7]。傳統血清學篩查的準確率只有60%～70%[8]，極易錯篩漏篩。介入性產前診斷雖準確度高，但國內外文獻顯示，行有創產前診斷的孕婦約2%被確診胎兒染色體異常，可因羊水穿刺或絨毛取樣造成的胎兒相關并發癥卻高達0.5%～1.0%[9]，因此會引起部分孕婦的抵觸心理，對于有流產、傳染病和感染風險等孕婦也不適用有創產前診斷。此外，隨著二孩政策的開放，孕婦數量增加，侵入性產前診斷技術因檢測時間長，技術要求高，檢測通量低，已遠遠不能滿足臨床的需求，因此NIPT的問世，彌補了目前臨床篩查的部分缺陷，為孕婦提供了多一個選擇。

本研究中，12 342例血清學臨界風險病例中，年齡<35歲共10 043例，占了81.37%，26例確診為胎兒染色體異常。在NIPT問世之前，血清學篩查臨界風險孕婦需做有創性產前診斷明確是否染色體異常，而本組人群中只有26例為染色體異常者，因此無創基因檢測的出現大大降低了穿刺率。另外一組年齡≥35歲以上共2299例，占了18.63%，8例確診為胎兒染色體異常,若按我國母嬰保健法規定，凡是年齡≥35歲的產婦都建議進行產前診斷，2299例孕婦都需要選擇羊水或臍血穿刺，出現過度診斷的現象。同時因介入性產前診斷的創傷性，有可能會發生早產，宮內感染，流產等風險，致使部分孕婦產生恐懼心理，不愿檢測，以致沒能及時診斷，導致異常胎兒的出生，給家庭和社會帶來巨大負擔。有學者研究顯示血清學篩查臨界風險是選擇無創產前篩查最常見的指證[4, 10],而該群體往往是染色體異常最容易漏診的人群[11]。故無創產前基因檢測技術作為二線的篩查方法，能更準確地檢測出染色體非整倍體，為血清學臨界風險孕婦提供了一個很好的選擇，可以減少有創產前診斷數量，緩解了她們因可能要面臨介入性產前診斷而產生的心理壓力。

隨著NIPT在臨床中的發展應用，NIPT的檢測譜也在增加，但主要用于檢測21-三體、18-三體、13-三體綜合征。本研究中NIPT檢測結果提示高風險74例，常見染色體非整倍體(21-三體、18-三體、13-三體綜合征)占了55.41%(41/74)，復合PPV為60.98%。NIPT診斷21-三體、18-三體、13-三體綜合征的靈敏度均為100%，陽性預測值分別為 71.43%、33.33%、40.00%。彭海山等[10]研究顯示，21-、18-、13-三體綜合征的靈敏度為 100%、91.67%、100.00%，陽性預測則為88.06%、78.57%、33.33%；羅麗雙等[11]報道了5756例孕婦NIPT的21-三體、13-三體、18-三體綜合征及性染色體異常的陽性預測分別為 86%、40%、25%。本研究與國內一些研究者對NIPT在常見染色體非整倍體的診斷效能評價比較，結果相近。18-三體、13-三體陽性預測較低，可能與本研究樣本例數少有關，但其靈敏度均可達100%，特異度分別為99.94%、99.98%、99.95%。由此可知，NIPT 對 21-三體、18-三體、13-三體綜合征在不同人群中都能很好的篩檢出，可成為血清學臨界風險人群孕檢的一線篩查手段。另外本研究還分析了NIPT對性染色體異常篩查的靈敏度為100%，特異度為 99.86%，PPV為 22.73%；對染色體缺失/重復篩查的靈敏度為100%，特異度為99.94%，PPV為36.36%。NIPT可一定程度上檢測性染色體異常和染色體缺失/重復，在非目標篩查疾病中也有一定的應用價值。

雖然NIPT的準確性高，但也存在假陽性和假陰性的局限。本研究中NIPT高風險者中有40例染色體核型分析未見異常，其合計假陽性率為0.32%，因此NIPT僅可作為高精確度的篩查方法，在臨床工作中應做好NIPT檢測前和檢測后的咨詢工作。當NIPT提示相關染色體異常時，后續需要結合B超排查胎兒畸形風險，進一步行介入性產前診斷，通過染色體核型和CMA確診。

綜上所述，NIPT的臨床應用對于血清學篩查臨界風險孕婦具有很好的檢測效能，降低血清學臨界風險孕婦的穿刺率，降低出生缺陷的發生。NIPT是血清學產前檢測技術的必要補充手段，在臨床工作還要做好NIPT檢測前后的咨詢工作。今后，對于如何提高非目標染色體預測的準確度，是我們的研究重點。