異常血紅蛋白Hb Phnom Penh[α117(GH5)Phe-Ile-α118(H1)Thr (α1)]家系的分子診斷與臨床特征分析

姚翠澤 張蕊 秦丹卿 王繼成 梁杰 梁凱玲 杜麗*

(1.廣東省婦幼保健院 醫學遺傳中心，廣東 廣州 511442；2.惠州市第二婦幼保健院產前診斷中心，廣東 惠州 516000)

血紅蛋白(hemoglobin，Hb)是人體內運輸氧的載體，每個血紅蛋白由2條(珠蛋白鏈和2條(珠蛋白鏈組成，而珠蛋白基因發生缺陷導致珠蛋白鏈分子結構發生異常，稱為異常血紅蛋白。若這種珠蛋白氨基酸異常發生在血紅蛋白分子內部，對其空間構象和功能影響較大，則臨床表現明顯；若這種改變發生在血紅蛋白分子外部，則對其影響不大，沒有明顯的臨床表現[1]。目前血紅蛋白變異體數據庫(http:∥globin.bx.psu. edu/)已報道了1800余種珠蛋白變異體，其中包括1300余種異常血紅蛋白。在中國南方人群中常見的α-珠蛋白鏈上的異常血紅蛋白主要有Hb Constant Spring (Hb CS)、HbQuang Sze (Hb QS)、HbWestmead (Hb WS)、Hb Q-Thailand等變異類型，若同時復合其他α0缺失型突變時會導致Hb H病，出現貧血癥狀[2]。鑒于此情況，異常血紅蛋白的篩查和分子診斷需要得到臨床工作者的重視。本研究檢測到一種少見的異常血紅蛋白Hb Phnom Penh [α117(GH5)Phe-Ile-α118(H1)Thr (α1)] 并對其進行了全面的家系調查和臨床表型分析，現報道如下：

1 對象與方法

1.1 對象

1.1.1 先證者男，36歲，廣東省惠州市人。其妻子曾生育一男孩，于孕20+周夫婦雙方在惠州第二婦幼保健院行地中海貧血(地貧)篩查，檢出先證者血紅蛋白電泳Hb A2值低，遂轉入本院進一步行地中海貧血基因檢測。

1.1.2 家系其他成員該家系成員主要包括Ⅰ1(先證者父親)、Ⅰ2(先證者母親)、Ⅱ2(先證者妻子)、Ⅱ3(先證者妹妹)、Ⅲ1(先證者兒子)、Ⅲ2(胎兒，孕20+周)，家系圖如圖1所示。

圖1 異常血紅蛋白Hb Phnom Penh病例家系圖

1.2 研究方法

1.2.1 血液學分析 乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝采血管采集外周血2ml，采用XN5000全自動血細胞分析儀及配套試劑(日本Sysmex公司)進行紅細胞參數分析。采用法國CAPILLARYS 2 FLEX PIERCING全自動毛細管電泳分析系統及配套試劑(法國Sebia公司)進行血紅蛋白組分分析。

1.2.2 DNA制備和地中海貧血基因診斷 采用MagPure Tissue & Blood DNA KF Kit試劑盒(廣州美基生物)提取外周血基因組DNA，應用Qiagen DNA 提取試劑盒從羊水脫落細胞中提取胎兒DNA；應用PCR-流式熒光雜交法對中國南方常見的23種地中海貧血突變進行檢測，包括：3種α-地中海貧血缺失型(-α3.7/、-α4.2/、--SEA/)，3種α-地中海貧血點突變型(αQSα/、αCSα/、αWSα/)及17種β-地中海貧血點突變(CD41-42、IVS-II-654、-29、-28、CD71-72、CD17、CD43、CD26、CD27-28、CD31、-32、-30、CD14-15、IVS-I-1、IVS-I-5、Int、Cap)(試劑盒購自中山大學達安基因股份有限公司)

1.2.3 α-珠蛋白基因測序 用Primer Premier5.0軟件針對α-珠蛋白基因設計2對引物(引物由上海生工生物合成)，分別擴增α1-和α2-珠蛋白基因(HBA1和HBA2)，PCR擴增后產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送生工生物有限公司進行雙向測序。引物序列如下：HbA1 5’-TGGAGGGTGGAGACGTCCTG-3’和5’-TCCATCCCCTCCTCCCGCCCTGCCTTTTC-3’；HbA2 5’-TGGAGGGTGGAGACGTCCTG-3’和5’-CCATTGTTGGCACATTCCGG-3’，擴增產物大小分別為1181 bp和1085 bp。PCR擴增條件：95℃預變性5 min，95℃ 30 s→66℃ 30 s→72℃ 1 min，33個循環，72℃延伸10 min。

2 結果

2.1 血液學參數分析 該家系中異常血紅蛋白Hb Phnom Penh雜合子成員Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅲ1紅細胞參數[Hb、平均紅細胞體積(mean corpuscular volume，MCV)、平均紅細胞血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)]均為正常，無小細胞低色素性貧血癥狀，詳細參數見表1，毛細管血紅蛋白電泳顯示無異常血紅蛋白帶。

表1 Hb Phnom Penh病例家系成員血細胞參數、血紅蛋白電泳及基因型

2.2 基因檢測結果分析 液相芯片法結果提示該家系成員除Ⅱ2為東南亞型缺失雜合子以外，其他成員結果均為陰性。α-珠蛋白基因測序檢出該家系成員Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅲ1(先證者父親、先證者、先證者兒子)均為α1珠蛋白基因第117/118密碼子中間插入三聯體ATC (codon 117/118+ATC)雜合突變，結果如圖2所示。經與血紅蛋白數據庫比對(http:∥globin.bx.psu.edu)，該突變為異常血紅蛋白Hb Phnom Penh。家系成員基因型結果見表1。

圖2 α1珠蛋白基因第117/118密碼子雜合突變(codon 117/118+ATC)的反向測序結果

3 討論

本研究中先證者的血液學各參數(Hb 148g/L、MCV 88.8fL、MCH 30.3pg)均在正常值范圍內，血紅蛋白電泳Hb A2略低于2.5%，無異常血紅蛋白帶檢出，提示可能攜帶α-地中海貧血。因先證者妻子常規地中海貧血基因檢測結果為--SEA/αα，為避免地中海貧血患兒的出生，先證者是否攜帶同型其他基因突變以及針對雙方攜帶的基因突變類型進行產前基因診斷尤為重要。該先證者經常規的地中海貧血基因檢測后未發現異常突變，遂對其進行了α-珠蛋白基因測序，測序結果顯示α1珠蛋白基因第117/118密碼子雜合突變 (codon 117/118+ATC)。隨后，我們對其家族三代成員進行家系調查，研究發現Ⅰ1(先證者父親)、Ⅱ1(先證者)、Ⅲ1(先證者兒子)均為Hb Phnom Penh雜合子。

α-地貧廣泛分布于世界許多地區，在我國長江以南各省發病率較高，其中廣東、廣西人群中的發病率分別高達4.11 % 和14.95 %[3]。α-地中海貧血大多數是由于α-珠蛋白基因缺失引起的α+和α0-地中海貧血較為常見，除了常見的--SEA、-α3.7、-α4.23種片段缺失類型以外，閱讀框內的缺失也屢有報道[4-7]，而閱讀框內插入突變較為少見。本研究的惠州家系病例先證者檢測為Hb Phnom Penh [α117(GH5)Phe-Ile-α118(H1)Thr (α1)]是一種比較少見的由于閱讀框內插入突變引起的異常血紅蛋白，這種插入突變通過基因測序定位于α1珠蛋白基因第三個外顯子上，于第117/118號密碼子中間插入三聯體ATC(異亮氨酸殘基)。Hb Phnom Penh于1998年在一名柬埔寨兒童和他父親的病例中首次報道[8]，隨后在中國和泰國人中也相繼報道了Hb Phnom Penh突變體的病例且Hb Phnom Penh雜合子血液學參數均為正常[9,10]，與本研究家系中檢出的Hb Phnom Penh雜合子成員的血液學表型一致。Wajcman等[8]研究認為Hb Phnom Penh突變的形成可能是由于該插入突變位點前后堿基序列趨向于發生堿基互補配對而容易發生斷裂，通過基因轉換補償機制形成TCATCA的重復，使得α-珠蛋白鏈上的氨基酸數量由141個增加到142個氨基酸，但經血紅蛋白毛細管電泳和高相液相色譜檢測均無異常血紅蛋白帶被檢出[10]，且異丙醇沉淀和熱不穩定性實驗也均為陰性[9]。以上病例研究將Hb Phnom Penh雜合子定義為α+-地中海貧血類型，無貧血癥狀。遺憾的是我們沒有對該家系Hb Phnom Penh突變進行功能性研究，無法了解該種突變對α-珠蛋白鏈表達的影響。既往多個研究報道[9,11-13]，Hb Phnom Penh雜合突變復合其他地中海貧血突變可引起小細胞低色素的臨床表型，提示盡管Hb Phnom Penh雜合子無臨床表型，但當復合其他α0-地中海貧血突變時可能加重臨床表型，出現貧血癥狀。此外，有研究在攜帶該突變病例中發現應用高相液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測時出現糖化血紅蛋白值(HbA1c)偏高的現象，揭示這種異常血紅蛋白會干擾 HbA1c 的HPLC測定，為臨床檢測準確性帶來影響[9,13]。

目前針對此類無明顯臨床表現的異常血紅蛋白病例僅通過血常規、毛細管電泳、HPLC以及常規的地中海貧血基因檢測容易導致漏診，必須通過α-珠蛋白基因測序或其他檢測手段就罕見突變類型進行明確的分子診斷，在臨床檢測過程中應加以重視。本研究對于Hb Phnom Penh雜合子的臨床特征分析和分子診斷可以提高臨床工作者對該種異常血紅蛋白的認識并為異常血紅蛋白病的臨床診斷和遺傳咨詢提供參考。