一種小片段缺失型β地中海貧血的血液學特征分析和產前診斷

王繼成 姚翠澤 秦丹卿 黃華潔 袁騰龍 杜麗

(廣東省婦幼保健院 醫學遺傳中心、廣東省婦幼代謝與遺傳病重點實驗室，廣東 廣州511442)

地中海貧血(簡稱地貧)是一組常見于我國南方地區的遺傳性血液病，主要分為α地貧和β地貧兩類。β地貧是由于β珠蛋白基因(HBB)突變導致β珠蛋白肽鏈合成缺如或減少，致使α/β珠蛋白肽鏈比例失衡而引起的溶血性貧血。與缺失型多見的α地貧不同，β地貧主要是由HBB基因點突變所致。迄今為止，全球已發現200余種HBB基因致病突變，其中CD41-42(-TCTT)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、CD17(A>T)、CD26(GAG>AAG)、-28(A>T)和CD71-72(+A)等6種突變，共占我國南方地區全部突變類型的90%以上[1,2]。目前臨床上通常運用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)結合反向點雜交(reverse dot blot，RDB)的方法或液相芯片技術，檢測中國人最常見的17種β珠蛋白基因突變[3]，而對于其他類型的突變，需要使用其他檢測技術才能發現。我們對通過基因測序發現的7例HBB: c.268_281delAGTGAGCTGCACTG (CD89_93-14bp)雜合突變的β地貧患者進行血液學特征分析，并對其中3個家系實行了產前診斷，報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2012～2019年就診于廣東省婦幼保健院，經珠蛋白基因檢測確診為β地貧(CD89_93-14bp)的7例患者。其中6名患者為廣東籍，1名患者為江西籍居民。年齡為19～35歲，包括成年的4名男性和3名女性。采集所有患者外周血用作血常規和血紅蛋白電泳分析，提取外周血基因組DNA用于珠蛋白基因檢測。于孕16～20周，對3個家系的孕婦行羊水穿刺進行地貧的產前診斷。

1.2 研究方法

1.2.1 血液學參數分析 運用Sysmex XS.1000i全自動血細胞分析儀(日本希森美康株式會社)對外周血進行包括血紅蛋白量及平均紅細胞體積(mean corpuscular volume，MCV)、平均紅細胞血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)等紅細胞參數分析。使用快速電泳分析系統(法國sebia capillary2)對外周血進行血紅蛋白組分分析。

1.2.2 珠蛋白基因診斷 采用QIAmp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取外周血和羊水細胞的基因組DNA。應用由中山大學達安基因股份有限公司提供試劑的液相芯片技術檢測3種常見缺失型和3種點突變型α地貧及17種β地貧突變。設計引物對HBB基因分成3個片段進行擴增和Sanger基因測序。PCR引物序列見表1。PCR擴增體系為30μl：15μl的PremixLA,10 pmol/μl的引物各2μl，4μl基因組DNA。反應條件為95℃預變性5min，95℃ 30s→60℃ 45s→72℃ 45s，共35個循環，72℃延伸。1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物。將PCR擴增產物送廣州生工生物有限公司使用美國ABI3100 DNA測序儀進行雙向測序。

表1 HBB基因測序引物序列

2 結果

2.1 分子診斷和產前診斷結果 常規地貧基因檢測未發現7例患者有突變，基因測序結果表明7例患者均為β珠蛋白基因小片段缺失(HBB: c.268_281delAGTGAGCTGCACTG)雜合突變，突變的測序結果見圖1。7例患者中，有3例患者的配偶經常規地貧基因檢測顯示為常見的β0或β+地貧，β地貧產前分子診斷結果顯示2個胎兒遺傳了父母一方的此種小片段缺失突變，1個胎兒β地貧未見異常突變。結果見表2。

圖1 HBB: c.268_281delAGTGAGCTGCACTG測序圖

2.2 血液學參數結果 7名患者的血液學參數與常見的β0地貧相似， Hb、 MCV和MCH有明顯的降低，均表現為小細胞低色素性輕度貧血。血紅蛋白電泳組分分析可見輕度升高的Hb F和Hb A2，這些都顯示HBB: c.268_281delAGTGAGCTGCACTG這種小片段缺失突變會導致β0地貧。所有患者詳細的血液學參數結果見表3。

表2 3個家系β地貧產前診斷結果

表3 7名患者血液學參數結果

3 討論

β地貧具有高度的遺傳異質性，在不同的種族人群中也有不同的基因突變譜。在我國南方地區已報道的近50種β珠蛋白基因突變中，多數是HBB基因上的點突變。此外也有少數β地貧是由包括HBB基因在內的β珠蛋白基因簇大片段缺失導致的[4,5]。而在HBB基因上也發現幾種小片段缺失突變，其中以CD41-42(-TCTT)最為常見，其次是5’UTR;+40-43(-AAAC)較為多見[6]。這2種突變都在臨床上17種β地貧突變檢測范圍內，通常都能檢測出。然而包括CD89-93在內的小片段缺失突變如果不進行基因測序，就很難發現。

Shang等[7]于2011年中首先報道了CD89-93突變，此后這種突變的病例被零星地報道[8,9]。非3個核苷酸整倍數的缺失或插入會引起移碼突變，其結果多數會造成終止密碼子的提前或推后出現，從而導致編碼的肽鏈的縮短或延長。CD89-93間的14個核苷酸(AGTGAGCTGCACTG)的缺失就會在CD89上提前出現終止密碼子TGA,結果就是生成比正常β珠蛋白鏈明顯縮短的截短蛋白。這樣的蛋白或者不穩定容易降解，或對正常的β珠蛋白發生競爭性抑制，從而引起β0地貧[10]。臨床上通常對血液學參數異常(MCV<80 fL、MCH<27 pg)和血紅蛋白電泳HbA2>3.5%的病例就考慮是β地貧的可能。本研究中7名患者的MCV、MCH和HbA2的結果都符合β0地貧的表現，與曾勁偉等[11]報道的病例相似，而常規地貧基因檢測并未發現異常突變，這時就需要應用其他檢測技術進一步基因診斷。所以常規地貧基因檢測結果需要與篩查結果結合臨床表現綜合分析。

由于β+/β0和β0/β0會引起中重度地貧，對于夫妻一方有檢測出β+或β0地貧，更需要明確地貧篩查結果異常病例的突變類型，從而避免中重度β地貧患兒的出生。本研究中對3個明確地貧突變類型的家系進行了產前診斷，幸運的是其中2個胎兒只遺傳了CD89-93一種突變，另1胎兒完全未遺傳父母的突變基因。我國廣東、廣西和海南等南方地區是地貧的高發區域[12]，雖然罕見地貧基因型尤其是小片段缺失型β地貧在人群中所占的比例不高，但是進行此類罕見突變的檢測和研究仍很有必要，因為只有精確診斷突變類型，才能給產前診斷和遺傳咨詢提供重要的參考意義。總之，隨著對地貧基因突變譜的認識的加深，聯合使用包括GAP-PCR、MLPA、CMA和基因測序在內的多種分子診斷技術，就會發現更多的大片段或小片段缺失型β地貧。