產前診斷中CNV-seq與核型分析聯合應用的意義

郭利麗 丁建林 王少帥

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院 婦產科，湖北 武漢 430000)

隨著我國經濟技術的發展，人們受教育水平的提高，大家對優生優育的概念日益重視。目前因病毒感染、藥物使用不當、營養不良等因素導致的胎兒發育異常比例下降，而遺傳因素引起的出生缺陷檢出率升高[1]。其中染色體病是導致出生缺陷最常見原因之一，幾乎占據了1歲之前確診的先天性異常患兒的15%[2]，且常為致愚、致殘、致死性，難以治療、預后差，給家庭和社會造成極大的負擔，嚴重影響人口素質。因此，染色體異常疾病的預防和早期診斷具有重要的意義。

在產前環境中，染色體異常表現形式多種多樣，從多倍體到全染色體的非整倍體，再到只能用基于DNA拷貝數方法檢測的微重復微缺失。傳統經典的染色體G顯帶技術只能穩定區分大于10M的缺失和重復以及大片段的結構重排。而基于高通量測序方法的染色體拷貝數變異檢測(copy number variation sequencing，CNV-seq)雖然分辨率是G顯帶技術的100倍，但只能檢測總體染色體數目的改變而不能檢測結構的重排，所以在產前診斷中兩種方法相結合是否可以提高異常染色體的檢出率有待探討。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究選取了2019年1～9月在華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院婦產科因具有產前診斷指征而行羊膜腔穿刺術的10例孕婦，年齡23～40歲，孕18～30+2周，所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 孕婦在傳染病4項、凝血常規、心電圖、血常規等檢查結果無異常后，簽署知情同意書，B型超聲輔助行羊膜腔穿刺術。無菌條件下取羊水約30ml，均分在3份無菌管中，其中2份羊水分別放在2個獨立的細胞培養箱中培養，行傳統的羊水細胞染色體核型分析技術，1份行CNV-seq檢查。培養的羊水細胞視生長狀況一般于10～14d后收獲，常規制片G顯帶，核型計數30個細胞，分析3～5個以上分裂象，根據《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN)(2016)》描述染色體異常核型。

2 結果

本研究從2019年1～9月在華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院產前診斷中心行羊膜腔穿刺術的人群中選取了10例結果具有代表性的病例進行分析。其檢測結果和孕婦信息如表1所示。9例羊膜腔穿刺后同時行羊水核型分析和CNV-seq，只有1例孕婦其兩種不同檢測方法的結果相同，其余8例均不同。例9因孕30+2周，錯過羊水細胞培養的最佳時間又因臍血不宜獲取而只行羊水CNV-seq檢測。

3 討論

3.1 染色體核型分析與CNV-seq聯合應用可相互驗證胎兒染色體的數目異常 染色體數目異常是產前診斷中最為常見的胎兒染色體異常，可引起嚴重的出生缺陷，而有些染色體的數目異常并不會引起胎兒的結構異常，所以必須經過羊膜腔穿刺術后行染色體檢查才能被確診。例10可以證明無論是需要進行羊水細胞培養后制片顯帶的染色體核型分析技術，還是不需要培養直接提取羊水中胎兒DNA進行測序的CNV-seq技術，都可以準確地檢測胎兒染色體的非整倍體異常。在產前診斷這個特殊環境中，同時使用兩種原理方法不同的檢測技術可以相互驗證其結果的準確性，若出現結果不相符可以及時行第三種檢測方法進行驗證以最大限度地降低缺陷兒的出生，減少漏診誤診。

3.2 染色體核型分析與CNV-seq聯合應用可明確胎兒染色體大片段重排的類型及意義 染色體核型分析可以檢測染色體的倒位、易位及羅伯遜易位的類型。最新研究表明染色體相互易位和羅氏易位在產前診斷樣本中占比約1.82%和0.89%[3]，若胎兒易位或倒位遺傳自雙親之一(病例1)，并不涉及遺傳物質的丟失或增加，則不影響胎兒的表型和智力發育[4]，只與未來的生殖咨詢相關，孕婦可繼續妊娠。而在產前診斷樣本中新發染色體平衡重排發生率約0.09%[5]，這種新發的明顯的平衡重排與6.7%的先天性異常相關[6]。這可能在發生重排的同時發生了其他拷貝數變異(copy number variation，CNV)，需要通過更高分辨率的檢測方法進一步確認。如本研究中的病例2，其核型分析結果為46，XX，t(6;8)(p25;q12),t(10;11)(q21;p15)，為明顯的平衡易位。CNV檢測顯示10q23.1-q23.31缺失5.78Mb，該缺失覆蓋了10q22.3-q23.2 缺失綜合征(OMIM#612242)約79%的區域；16號染色體p13.11處重復1.26Mb，覆蓋了 16p13.11復發性微重復(是神經認知紊亂敏感位點)綜合征約84%的區域，為一種非明確致病性改變，即易位的同時發生了G顯帶無法識別的CNV。病例3、病例4和病例5雖為新發易位或倒位，但經CNV-seq檢測，在染色體重排的同時并無致病性遺傳物質的增多或減少。因此，相互易位或倒位的胎兒攜帶者需聯合CNV-seq檢測確定染色體在發生重排的同時總體遺傳物質是否發生了改變，以提高診斷的精準度，減少漏診誤診。

表1 染色體核型分析與CNV-seq兩種檢測技術的結果比較分析

遺傳物質不發生改變的還有羅伯遜易位，根據易位染色體的種類分為同源性和非同源性，羅伯遜易位由于短臂小、遺傳基因較少，遺傳效應不明顯，這種患者與平衡易位攜帶者相似，不影響胎兒的表型和智力發育。而同源羅伯遜易位患者雖表型和智力發育正常但生育下一代時與正常配子結合后，理論上只能形成單體或三體型合子，不能生育正常的孩子[7]，所以當核型分析確定胎兒為同源羅伯遜易位時，即使CNV-seq檢測無總體遺傳物質的改變，遺傳咨詢時也應如實告知孕婦胎兒以后可能面臨的生育問題，讓其慎重考慮。

3.3 染色體核型分析與CNV-seq聯合應用可明確胎兒額外小標記染色體的性質 產前診斷中額外小標記染色體(small supernumerary marker chrosome，sSMC)的發生率為0.77‰，其中超聲檢查異常胎兒者發生率增高到2.04‰[8]，sSMC是否有表型效應與其來源、基因組含量、家族遺傳性、是否嵌合等因素有關。染色體核型分析可以直觀的看到sSMC的形態結構及位置，如本研究中的病例6，染色體核型分析結果為47,XY,+mar。除了有正常的46條染色體外，還發現1個額外小標記染色體，但不能確定其來源及是否致病。而CNV-seq檢測提示15q11.2q13.2重復7.86Mb及15q13.2q13.3重復2.08Mb，數據庫信息顯示該區域包括了15q11-q13重復綜合征(OMIM#608636)以及UBE3A基因(OMIM#601623)的全部，為一種致病性變異。通過CNV檢測可以得知核型分析中檢測到的sSMC應該為15號染色體長臂的一部分。結合兩項檢測結果，不僅明確了核型分析中sSMC的大小、來源、具體區域范圍，根據數據庫信息預測了胎兒的臨床表型，還確定了CNV-seq檢測到的15q11-q13重復片段的形態構象，讓檢測結果更直觀明了，方便患者理解。

3.4 CNV-seq檢測可額外診斷微缺失/微重復綜合征 基于高通量測序的染色體拷貝數變異可以檢測>100kb以上的微重復微缺失，隨著無創產前篩查技術(non-invasion prenatal test， NIPT)的開展和普及，越來越多的孕婦因NIPT中小片段的重復或缺失需要行羊膜腔穿刺術在產前做確診。如病例7，NIPT提示dup(4)重復需做確診。傳統核型分析的低分辨率已不能滿足此類患者的需求，此時求助于高分辨率的CNV-seq檢測，核型結果顯示正常，CNV-seq檢測顯示4q12重復2.72Mb，該區域包括TMEM165基因(OMIM#614726)的全部，其突變與先天性糖基化障礙2k型(carbohydrate deficient glycoprotein syndrome type 2k，CDG2K)(OMIM#614727)疾病相關，經數據庫查詢未發現該基因重復導致CDG2K的病例報道，所以該重復為意義不明確性(variants of unknown significance，VOUS)變異。病例8核型分析發現9號增加了一個未知來源片段，經CNV-seq檢測證明此片段來自9號染色體的q31.2q34.11，查詢數據庫發現有1例 9q33.3 重復患者表征為整體發育遲緩、特殊面容等，其父親攜帶此重復片段，并無明顯臨床表征。病例9孕30周因B超顯示羊水多，雙腎有回聲行羊膜腔穿刺術，CNV-seq結果顯示17q12缺失1.38Mb，覆蓋了腎囊腫和糖尿病綜合征(renal cysts and diabetes syndmme，RCAD)約98%的區域，并包含了該綜合征的關鍵基因HNF1B，主要累及腎臟功能，表現為腎發育不良、腎集合系統畸形等，是一種致病性缺失。此結果顯示的癥狀與孕婦的B超結果高度吻合。

以上這些異常均屬于因染色體失衡引起的微缺失/微重復綜合征(microdeletion/microduplication syndromes，MMS)，是一組重要的染色體疾病，占所有新生兒先天性畸形的1%～2%。在產前診斷中如果僅進行染色體核型分析，就會造成MMS的漏診。所以，在產前環境中行CNV-seq不僅可以解決NIPT中微小片段的產前診斷還可以有效避免染色體失衡引起的MMS遺漏，有效提高產前診斷率。

3.5 CNV-seq檢測VOUS結果的解讀對產前咨詢提出了新的挑戰 核型分析檢測到的染色體不平衡因涉及的片段大，改變的基因多，所以經常表現為完全顯性，如果正常的父母中也有相同發現則可預測為良性改變，對胎兒影響不大。然而，CNV-seq可以檢測亞微觀的不平衡，基于正常人群的研究表明正是人類染色體DNA序列的持續不斷改變，人類才得以進化和適應新的環境[9]，所以CNV并不總是可以引起異常表型，有些CNV是正常的，而有些可能為不完全顯性和(或)可變性表達，或在特定的遺傳變異體中表型才會體現，所以CNV-seq檢測結果會出現VOUS。因VOUS是人群中不常見的基因改變，所以有很少甚至沒有臨床證據可利用去評估他們的致病性，這就使得遺傳咨詢中解釋VOUS的CNV面臨新的挑戰。遺傳咨詢者可以利用公共數據庫和每年新報道病例幫助患者確定CNV的性質。一般而言，CNV遺傳自表型正常的父母其臨床相關性降低；然而，外顯不全和(或)可變性表達的CNV，因病人的臨床表型各不相同，無法預測產后結局，尤其是涉及神經發育紊亂方面更是無法預估[10]?；诖?，遺傳咨詢者在產前診斷前應和孕婦做好溝通，將所有可能情況告知患者，由患者知情決定。

雖然CNV-seq檢測為遺傳咨詢提出挑戰，但其優勢還是顯而易見的，在產前環境中該技術已經成為備受關注的標準，比傳統的核型分析提高約5%的檢出率[11]。一項對從事產前遺傳咨詢者的橫向研究表明，95%的遺傳咨詢者會將CNV應用到產前診斷中，71%的會介紹給所有需要進行羊水穿刺的孕婦[12]。美國婦產科協會(The American Congress of Obstetrics and Gynecology，ACOG)和母胎醫學學會(Society for Maternal-Fetal Medicine，SMFM)推薦在產前診斷中超聲檢查胎兒有重要結構異常時執行高通量測序方法[13]。但在結構正常的胎兒中也有將近1.7%的致病性CNV被報道[11]。因此，一些官方提倡在所有侵入性產前診斷中應用高通量測序方法[14,15]。最近ACOG和美國國立衛生研究院(National Institutes of Health，NIH)資助的臨床基因組資源中心(ClinGen)聯合發布了《原發性拷貝數變異解讀與報告技術標準》，CNV將使用明確的打分制度，根據不同致病性的證據進行分數的加減[16]，這為產前及遺傳病檢測領域CNV報告的解讀提供了指導和參考。

4 總結

產前診斷是降低出生缺陷的主要途徑，而出生缺陷原因復雜多樣，產前環境又較為特殊，需要在有限的時間內給出有效的診斷，對于遺傳病因不明確的異常表型，最好結合使用多種技術。通過分析本研究中的病例可以知道隸屬于細胞遺傳學的染色體核型分析技術和歸于分子診斷學的CNV-seq技術在染色體疾病檢測方面各有利弊，兩種方法聯合使用既能相互驗證檢出的異常核型，又能互相補充不同種類的異常核型，聯合應用可以有效提高產前診斷的異常核型的檢出率，對減少遺傳缺陷患兒的出生具有重大的社會效益。CNV-seq結果的解讀為遺傳咨詢提出了挑戰，隨著行業標準的出臺，CNVs報告的解讀有了更多的指導和參考，隨著人群大數據的建立和病例的不斷積累，相信產前診斷技術和咨詢會發展更好。