弓形蟲基因缺失疫苗研究進展

李龍嬌

（重慶三峽職業學院，重慶404020）

剛地弓形蟲作為寄生原蟲之一，可感染包括人在內的多種溫血動物。弓形蟲疫苗一直被認為是防治弓形蟲病最有效的手段之一，目前基于蟲體基因缺失的弱毒疫苗研究較為廣泛[1-3]。本文主要就弓形蟲基因缺失疫苗的最新研究進展，對作為疫苗候選的弱毒蟲株的潛力和發展方向做簡要介紹，以期為研制安全有效的弓形蟲疫苗提供一定參考。

弓形蟲病作為人獸共患寄生蟲病之一，可感染多種畜禽。豬弓形蟲病在全世界范圍內均有流行，妊娠豬感染后出現高熱、厭食、流產等癥狀，同時蟲體可經胎盤傳播給仔豬，進而影響仔豬的生存和生產，給養豬業帶來損失。更為嚴重的是，它可感染有免疫缺陷的人群，造成腦炎、視網膜炎等疾病；同時弓形蟲感染可致婦女在妊娠期間出現流產、產死胎或畸形胎。多年以來，弓形蟲病嚴重威脅著世界各國畜牧業的發展和公共衛生安全。而目前研發出良好的弱毒疫苗被認為是有效預防弓形蟲病的最佳策略。

1 基因缺失蟲株的意義

近年來，分子生物學領域得益于高效的基因編輯技術（如Cre-loxp、CRISPR/Cas9技術等）及其迅速發展，尤其是CRISPR/Cas9作為第三代基因編輯技術已被開發為可以在任何遺傳背景下進行高效率的定點基因編輯，其對于DNA編輯和調控條件基因的表達有著顯著的優勢。在此背景下，基因缺失蟲株便是運用基因編輯技術對弓形蟲的毒力或代謝基因進行敲除，其目的是希望敲除毒力或代謝基因后的蟲株仍保留有免疫原性，可以刺激機體產生特異性免疫應答反應但卻失去致病力，進而為弱毒蟲株疫苗的開發提供參考。

2 基因缺失候選蟲株

2.1 GRAROP蛋白家族基因缺失蟲株

致密顆粒蛋白家族（GRAs）和棒狀體蛋白家族（ROPs）是弓形蟲重要的分泌蛋白，不僅與蟲體入侵、逃逸等過程密切相關，同時還是納蟲泡的重要組成成分。有研究表明，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對GRA17基因進行敲除，成功構建了PruΔGRA17蟲株，發現該基因敲除蟲株可以誘導小鼠產生高水平體液免疫，降低野生型RH蟲株、Pru蟲株對小鼠的感染。對GRAs新成員TGGT1_319340進行基因敲除后，發現蟲體的生長受到了較大抑制。另外有學者發現，GRA12的缺失會影響蟲株的致病力，若將GRA12和ROP18或者ROP5和ROP18聯合敲除，形成的RHΔGRA12ΔROP18蟲株、RHΔROP5ΔROP18蟲株感染小鼠后致病力顯著降低。不僅如此，在Ⅱ型蟲株ME49中同樣發現ROP5和ROP18缺失后接種小鼠，可以增加小鼠的存活率。

2.2 CDPK基因缺失蟲株

鈣依賴蛋白激酶家族（Calcium-dependent pro?tein kinases，CDPKs）廣泛存在于植物和頂復門寄生蟲中，調節著胞內外鈣離子信號通路。研究表明，CDPKs調節著弓形蟲蟲體滑行、入侵和溢出等多個重要過程，其中CDPK2是支鏈淀粉代謝中必須的調節因子，對弓形蟲緩殖子的發育具有重要的作用。有學者利用CRISPR/Cas9技術對Pru蟲株CDPK2基因進行敲除后，發現PruΔCDPK2蟲株接種的小鼠產生了高水平的免疫保護力，可以顯著降低Ⅰ型蟲株對小鼠的致死率。盡管CDPKs中還有不少成員都得到了功能鑒定和基因缺失蟲株的構建，但目前PruΔCDPK2蟲株是最具有疫苗開發潛力的基因缺失蟲株。

2.3 糖代謝基因缺失蟲株

在弓形蟲的糖代謝途徑中，糖酵解途徑在速殖子和緩殖子時期都有所表達。前期研究發現，糖酵解途徑中有兩個催化丙酮酸與乳酸進行相互轉化的關鍵酶，分別是乳酸脫氫酶1（LDH1）和乳酸脫氫酶2（LDH2）。在ME49蟲株中對LDH1基因敲除后，蟲體的毒力和形成包囊的能力降低；而對LDH1和LDH2同時進行敲除后，發現ME49ΔLDH蟲株雖然可以在體外進行生長，卻無法在體內進行繁殖。在后續的小鼠免疫評估試驗中又發現，ME49ΔLDH可誘導產生高水平免疫球蛋白G（IgG），有效抵抗RH、ME49等野生型蟲株的感染，及時清除感染蟲體。不僅如此，ME49ΔLDH蟲株在免疫接種的早期可誘導高水平的細胞免疫，使宿主產生抵抗弓形蟲的主要細胞因子γ干擾素（INF-γ）。接種了ME49ΔLDH蟲株的小鼠，脾細胞還產生了高水平的細胞因子，如INF-γ和α腫瘤壞死因子（TNF-α）。

3 小結

由于近年來基因編輯技術的廣泛應用以及取得的顯著的成果，學者們已將其用于弓形蟲弱毒疫苗的研究中。良好的弓形蟲弱毒活疫苗不僅可以誘導機體產生有效的免疫保護力，抵抗不同階段的野毒蟲株感染，并且不會在機體內殘留免疫蟲體，因此不會存有任何返毒和散毒的風險。

目前弓形蟲弱毒疫苗的研究常用的蟲株如T-263，可以抑制終末宿主貓體內卵囊的形成；S48蟲株可以在一定程度上預防弓形蟲引起的妊娠母羊的繁殖障礙。雖然傳統的弱毒蟲株可以刺激機體產生一定的免疫保護力，但其預防的動物范圍和蟲體發育階段具有局限性，并且存在有返毒甚至傳播弓形蟲等諸多風險。為解決上述問題，弱毒蟲株的研制轉向基因缺失蟲株的構建，此系列蟲株具有免疫原性好、遺傳改造針對性強的特點。相信結合未來更為穩定高效基因編輯技術，研制出遺傳穩定、安全有效、應用性強的基因缺失疫苗指日可待。