飼料中沙門氏菌檢測(cè)技術(shù)的研究

王懷超

（濮陽(yáng)市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，河南濮陽(yáng)457000）

在現(xiàn)代畜牧業(yè)生產(chǎn)中，飼料內(nèi)沙門氏菌的存在是嚴(yán)重威脅養(yǎng)殖業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)主要因素，同時(shí)影響著社會(huì)公共安全。不同的沙門氏菌檢測(cè)技術(shù)各有優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)，應(yīng)用范疇方面也存在一定差異，只有全面了解這些差異，才能夠靈活、正確地采取相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)，最大限度地控制飼料中沙門氏菌的污染問(wèn)題。筆者對(duì)沙門氏菌進(jìn)行了簡(jiǎn)單的介紹，重點(diǎn)分析了檢測(cè)飼料沙門氏菌的傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，以供同行參考。

1 沙門氏菌概述

沙門氏菌以人畜共感染為主要特點(diǎn)，是無(wú)莢膜、無(wú)芽孢的一種病原菌。從沙門氏菌目前的研究進(jìn)展來(lái)看，已有超過(guò)2 000余種沙門氏菌血清型被公布了出來(lái)，我國(guó)在這方面的工作有很大的貢獻(xiàn)和突破，檢出300余種不同的沙門氏菌血清型，其中包括10多種國(guó)際新型沙門氏菌血清型。飼料一旦被沙門氏菌所污染，則可能傳播給人類或者動(dòng)物，需嚴(yán)格落實(shí)針對(duì)性的控制措施，重視飼料沙門氏菌的檢測(cè)工作，才能夠避免飼料內(nèi)出現(xiàn)沙門氏菌，消除飼料產(chǎn)品安全隱患。

2 檢測(cè)飼料中沙門氏菌的關(guān)鍵技術(shù)

2.1 沙門氏菌培養(yǎng)技術(shù)

在檢測(cè)飼料中沙門氏菌時(shí)，必須嚴(yán)格按照國(guó)際相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行，先進(jìn)行沙門氏菌的培養(yǎng)。常見(jiàn)的培養(yǎng)技術(shù)以常規(guī)微生物學(xué)為基礎(chǔ)，通過(guò)按以下程序進(jìn)行。

第一步，液體培養(yǎng)基內(nèi)的檢測(cè)樣品需先開(kāi)展預(yù)增菌操作，修復(fù)其中活性較差的沙門氏菌。

第二步，開(kāi)展分離純化和選擇性增菌的操作，在兩個(gè)不同選擇性增菌液中分別轉(zhuǎn)接預(yù)增菌，開(kāi)始培養(yǎng)，完成培養(yǎng)后再次分離純化，通過(guò)兩種不同選擇性瓊脂平板開(kāi)展，鑒定已經(jīng)純化好的沙門氏菌疑似菌落。

此過(guò)程的鑒定可以通過(guò)微生物生化鑒定系統(tǒng)或者商品化生化鑒定專門試劑盒完成。

第三步，采取血清學(xué)鑒定方法處理分離好且純化完成的沙門氏菌疑似菌落，對(duì)自凝現(xiàn)象進(jìn)行排查，針對(duì)沒(méi)有自凝的疑似菌落開(kāi)展Ⅵ抗原、H抗原、O抗原的檢測(cè)。

這種傳統(tǒng)且常見(jiàn)的沙門氏菌培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)，優(yōu)勢(shì)在于無(wú)假陽(yáng)性、準(zhǔn)確性高，缺點(diǎn)在于耗時(shí)較長(zhǎng)，操作程序繁瑣，通常整個(gè)檢測(cè)周期在6 d左右。

2.2 主要分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

目前檢測(cè)飼料中沙門氏菌的分子生物學(xué)檢測(cè)方法主要包括以下幾種。

2.2.1 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)法

熒光定量PCR技術(shù)目前廣泛應(yīng)用，發(fā)展速度較快，是深受歡迎的沙門氏菌快速檢測(cè)技術(shù)之一，解決了傳統(tǒng)PCR檢測(cè)過(guò)程污染概率大的問(wèn)題，彌補(bǔ)了假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)頻率高的不足，體現(xiàn)出了可定量、重復(fù)性高、特異性強(qiáng)、靈敏度強(qiáng)等技術(shù)優(yōu)勢(shì)。在具體檢測(cè)中多樣品的細(xì)菌定量和擴(kuò)增可以同時(shí)完成，常見(jiàn)于大批飼料樣品的沙門氏菌檢測(cè)工作，在檢測(cè)傳染病和食源性病原菌方面的作用非常大。

2.2.2 基因芯片檢測(cè)法

在飼料沙門氏菌檢測(cè)技術(shù)中，基因芯片檢測(cè)法是一種常見(jiàn)的快速檢測(cè)方法，利用沙門氏菌毒力因子、抗原和其致病性之間的關(guān)系，對(duì)腸道內(nèi)沙門氏菌通過(guò)基因芯片進(jìn)行快速檢測(cè)，進(jìn)而完成鑒定未知菌屬的工作。

2.2.3 核酸探針檢測(cè)法

核酸探針檢測(cè)法已經(jīng)融入了DNA-RNA雜交檢測(cè)技術(shù)，克服了傳統(tǒng)的鼠傷寒沙門氏菌檢測(cè)技術(shù)難題，適用于飼料食品的沙門氏菌檢測(cè)，探針具有更高的敏感性，通過(guò)48 h左右的增菌處理后，在專門實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成檢測(cè)操作。但因?qū)z測(cè)條件要求較高，所以實(shí)際推廣和應(yīng)用受到一定阻礙。從該技術(shù)研究現(xiàn)狀來(lái)看，以核酸探針為基礎(chǔ)的沙門氏菌比色劑檢測(cè)技術(shù)正在迅速興起，保持了檢測(cè)的高敏感性，同時(shí)讓無(wú)輻射檢測(cè)從不可能變?yōu)榱擞锌赡堋?/p>

2.2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法的核酸擴(kuò)增技術(shù)較為新穎、高效，優(yōu)點(diǎn)在于控制效率高和特異性較強(qiáng)，60～65℃環(huán)境下能在60 min內(nèi)完成擴(kuò)增，形成白色沉淀副產(chǎn)物，能利用沉淀濁度進(jìn)行反應(yīng)結(jié)果的判斷。

2.3 主要免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

目前飼料中沙門氏菌的免疫學(xué)檢測(cè)方法主要包括以下幾種。

2.3.1 免疫膠體金檢測(cè)法

對(duì)樣品抗原采取雙抗夾心技術(shù)進(jìn)行有效檢測(cè)，載體為硝酸纖維素膜，原理在于微孔膜具有毛細(xì)血管功能。在被檢飼料樣品內(nèi)浸入試紙下端，在毛細(xì)管作用下的樣品會(huì)向金標(biāo)抗體墊過(guò)濾并進(jìn)入，相應(yīng)抗原與金標(biāo)抗體進(jìn)行特異性結(jié)合，逐漸滲移向膜條，不會(huì)形成抗原抗體復(fù)合物，所以檢測(cè)試紙沒(méi)有紅色反應(yīng)。這種檢測(cè)技術(shù)常見(jiàn)于環(huán)境、飼料、食品中沙門氏菌的檢測(cè)，具有較高準(zhǔn)確性、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，但缺點(diǎn)是需要較高檢測(cè)成本。

2.3.2 特異性抗體介入檢測(cè)法

應(yīng)用特異性抗體介入檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè)時(shí)，需先在選擇性增菌液內(nèi)添加多克隆抗體，對(duì)干擾菌發(fā)揮出生長(zhǎng)抑制作用，防止干擾后期的選擇性分離。相較于一些常規(guī)檢測(cè)方法而言，特異性抗體介入檢測(cè)技術(shù)減少了沙門氏菌假陽(yáng)性結(jié)果的概率，不過(guò)也有技術(shù)缺點(diǎn)，主要體現(xiàn)在準(zhǔn)確性不足、制備繁瑣等方面。

2.3.3 斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法

斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法的固相載體為硝酸纖維素膜，反應(yīng)發(fā)生在膜上，抗體或抗原含量的判斷依據(jù)膜片中央出現(xiàn)的斑點(diǎn)深淺程度進(jìn)行。斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)沙門氏菌方法的優(yōu)點(diǎn)在于能長(zhǎng)期保存檢測(cè)結(jié)果、成本低、操作簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)在于產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果概率較大、特異性較低。

2.3.4 乳膠凝集檢測(cè)法

乳膠凝集檢測(cè)法檢測(cè)沙門氏菌的方法屬于間接凝集檢測(cè)試驗(yàn)，惰性載體為聚苯乙烯膠乳微粒（人工合成），表面能對(duì)可溶性抗原進(jìn)行吸附，結(jié)合特異性抗體發(fā)生凝集現(xiàn)象。此技術(shù)優(yōu)點(diǎn)在于無(wú)須特殊儀器、操作簡(jiǎn)單、可在基層現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)，缺點(diǎn)在于假陰性結(jié)果概率較高、敏感性不足。