Caspase信號途徑及其在乳腺癌治療中的作用研究進展

王 敏，李習平，楊 梅，齊 玲，張珍達，謝 薇

(貴州中醫藥大學第一附屬醫院，貴州 貴陽 550001)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，全球每年新發病例約167.1萬，每年病死病例約52.2萬。而在我國，乳腺癌每年新發病例約21萬，居女性惡性腫瘤之首，且近年來發病率呈逐年上升趨勢[1-3]。然而在乳腺癌當下的治療中，盡管方法不盡相同，但結果卻大同小異，依然呈現出高復發、高轉移和高死亡率等特點。因此，對乳腺癌發生、發展及轉移機制的進一步闡明對乳腺癌的繼續研究及防治至關重要。目前研究表明，乳腺癌具有多種分子亞型，且不同亞型對于化療、放療及靶向藥物等治療方式的敏感程度亦不盡相同。此外，目前在乳腺癌相關生物信息學方面的研究亦取得較大進步，不僅發現了一系列與乳腺癌相關的調控通路及信號因子，還對基因間相互作用做了較為系統的研究，從而為其早期診斷、分級治療和靶向藥物選擇提供了更為堅實的理論依據[4]。研究[5]指出，細胞凋亡異常是腫瘤、自身免疫疾病和神經退行性病變等發生和發展的重要影響因素。而正常的細胞凋亡程序亦是多細胞有機體維持體內平衡和發育過程的一個重要機制，其在腫瘤發生、發展中的負調控作用能夠有效遏制腫瘤細胞的增殖。已有研究[6]發現，在大多腫瘤組織(包括卵巢腫瘤、乳腺癌、胰腺癌和肝癌等)細胞中均存在 Caspase 系列蛋白(如Caspase-3、8、9等)異常表達，甚至某些Caspase家族蛋白在凋亡調節中起著重要的樞紐作用。現利用文獻總結Caspase信號通路在乳腺癌臨床治療中的研究進展，并進一步討論其在乳腺癌靶向治療中的臨床策略。

1 Caspase信號途徑概述

1.1 Caspase蛋白家族及分類 1993年，Yuan等發現秀麗隱桿線蟲(C.elegan)中的Ced-3基因與Ced-4基因是引導細胞凋亡的必經途徑，而哺乳動物中的IL-1β轉化酶(ICE)在功能和序列上又與Ced存在高度相似性，且都與細胞凋亡的誘導息息相關，故兩者在后來被統稱為天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate-specific proteinase，Caspase)。研究發現，所有Caspases均具N-端的半胱氨酸激活位點及底物裂解位點，其底物特異性由其裂解位點N-端的4個氨基酸殘基決定，底物裂解部位通常位于靶蛋白一級結構中的門冬氨酸殘基且數目不等。目前，在哺乳動物中已發現并克隆的Caspase系列蛋白酶共14種，按其在凋亡調節中作用的不同分為三類：①炎癥介導因子(如Caspase-1、4、5、11)除了介導炎癥反應外，還在死亡受體介導的細胞凋亡途徑中起著重要的輔助作用；②凋亡啟動因子處于級聯反應的上游，能夠接受上游凋亡信號發生自我活化和特異識別并激活下游凋亡效應Caspase，包括Caspase-2、8、9、10等，其中Caspase-8對幾乎所有效應Caspase分子均能激活而誘發凋亡[7]；③凋亡執行因子亦稱凋亡效應因子，處于級聯反應下游，主要承擔細胞凋亡過程，如Caspase-3、6、7，其中Caspase-3是細胞凋亡過程中的主要效應因子，它的活化是凋亡進入不可逆階段的一個重要標志[8]。

1.2 Caspase信號傳導相關凋亡途徑 目前，已知凋亡所涉途徑共有4條，分別為內源性途徑、外源性途徑、內質網途徑及顆粒酶B途徑。近年來，針對前兩種途徑的研究較多，而在顆粒酶B途徑和內質網途徑的了解上則相對較為薄弱。雖然4種途徑均有Caspase參與，但Caspase主要通過內源性和外源性途徑發揮凋亡調控作用。為了更為系統地了解細胞凋亡的調控機制，現就上述4種凋亡途徑及其常見調節信號因子進行綜述。

1.2.1 內源性途徑：該途徑又稱線粒體通路，通過胞內的死亡信號刺激線粒體外膜，誘導線粒體膜通透性發生改變，致使跨膜電位丟失，繼而釋放細胞色素C與胞質中凋亡激活因子(Apaf-1)相結合，再進一步激活Caspase-9酶原并與之結合組成凋亡復合體，活化后的Caspase-9 特異性切割Caspase-3使其活化，最終通過活化的Caspase-3促進核纖層核碎裂、蛋白分裂，從而導致凋亡[9]。此途徑眾多調節蛋白中，Bcl-2家族是最為重要的調節因子之一，包含抗凋亡成員(如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-W等)和促凋亡成員(如Bax、Bik/Nbk、Bad、Bid等)兩類，其凋亡調節作用取決于抗凋亡因子與促凋亡調節因子比中的優勢方，繼而通過細胞色素C的釋放進行細胞凋亡過程的調節。此外，生長因子的缺失、氧化應激、鈣超載、致癌因子激活以及DNA 損傷等因素均可激活內源性途徑。除細胞色素C外，線粒體還釋放核酸內切酶G、細胞凋亡誘導因子和凋亡抑制蛋白拮抗劑(SMAC)等，這些分子同樣可以促進Caspase 依賴途徑的細胞凋亡。

1.2.2 外源性途徑：該途徑又稱為死亡受體途徑或胞質途徑，依賴膜結合配體FasL和死亡受體并最終通過激活執行者Caspase系列蛋白而觸發凋亡。死亡受體系腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族重要成員之一。迄今共發現TNF受體30種，其中8種位于胞質內，被譽為“死亡域”，且TNF-R1、Fas(Apo1)、DR3(Apo2)、DR4(Trail-R1)、DR5(Trail-R2)及DR6這6種TNF的受體死亡域與Caspase凋亡途徑的激活息息相關。該途徑具體表現為：細胞膜外的FasL通過與細胞膜表面相應死亡受體結合構成死亡誘導復合物，繼而激活Caspase通路，開啟凋亡外源性途徑。外源性途徑影響因素眾多，如Bcl-2蛋白家族、NF-κB、p53、死亡受體、細胞周期相關因子等，其中p53是一種能通過對前凋亡成員Bax、Bak產生直接或間接作用而發揮促凋亡功能的抑癌基因，但也有報道稱某些突變體p53能夠通過調節脫氧尿苷三磷酸酶表達而抑制凋亡。近年來研究表明，內、外兩種凋亡調節途徑并非總是相互獨立的,亦可以相互交錯形成共同途徑，亦稱Caspase信號途徑。如在肝細胞凋亡的FAS應答途徑中，由于Caspase-8的活化水平不足，受外源性途徑激活的Caspase-8能夠促使胞漿中的Bid激活并向線粒體遷移，通過內源性途徑釋放SMAC進一步激活起始酶Caspase-8，進而將外源性途徑信號進一步放大，最終作用于執行酶Caspase-3，啟動相應凋亡程序[10]。

1.2.3 顆粒酶B(GrB)途徑：顆粒酶(Gr)是一類來自細胞毒T淋巴細胞(CTL)和自然殺傷(NK)細胞的絲氨酸蛋白酶。目前，已知顆粒酶共11種，在人類發現有GrA、GrB、GrH、GrK和GrM共5種，其中GrB凋亡誘發活力最強[11]。該凋亡過程表現為：當CTL受到刺激后，以穿孔蛋白和GrB為主的毒性顆粒被釋放到細胞外，通過多種途徑作用于相應靶細胞并引發凋亡的發生。研究[12]發現，GrB的凋亡調節途徑共有兩條，分別是Caspase依賴途徑和非Caspase依賴途徑。GrB可以分別通過切割凋亡促進因子Bid和凋亡抑制因子Mcl-1激活內源性途徑，誘發凋亡[13]。此外，GrB還可以直接遷移入核、直接激活除Caspase以外的胞漿底物或通過改變線粒體膜電位結構等非Caspase依賴性途徑啟動凋亡程序[14]。

1.2.4 內質網途徑：內質網作為蛋白合成、加工以及Ga2+儲存的重要場所，其在細胞凋亡調節中的作用近年來亦備受關注。目前已知，內質網主要通過Caspase-12、非折疊蛋白效應和內質網Ga2+異常3條途徑參與細胞凋亡[15]。研究發現，內質網內過多積累的未折疊蛋白會特異性地與肌醇依賴酶1-α(Ire1-α)競爭BiP/Grp78，從而導致剩余Ire1-α與能特異吸附并激活Caspase-12的死亡受體相關因子TRAF2結合，進而開啟凋亡過程。同時，Caspase-12也能被細胞內Ga2+激活的m-鈣激活酶切割并激活，且激活后的Caspase-12能直接通過激活Caspase-9，繞開線粒體途徑而誘發凋亡。此外，內質網途徑在通過Caspase-12直接開啟凋亡程序時，其釋放的Ga2+還可以直接引起線粒體膜通透性及膜電位改變，導致線粒體凋亡物質的釋放，從而啟動和實施凋亡。有報道稱，線粒體途徑的細胞色素C能與Ga2+釋放影響因子肌醇1,4,5-三磷酸(InsP3)直接結合，引起Ga2+通道開放，從而增強對線粒體通路和內質網通路的刺激，進一步促進凋亡的發生。由此看來，內質網途徑與線粒體途徑在細胞凋亡的調控中亦并不是完全孤立的，而是可以相互作用的[16]。目前對于Caspase-12的激活機制尚不明確，有研究[17]認為被活化的Caspase-12從內質網到細胞漿中首先作用于Caspase-9，再激活Caspase-3引起細胞凋亡，或Caspase-12直接激活了Caspase-3。而且，在近年對以上凋亡途徑的研究中，尚未發現Caspase-12參與內、外源性途徑，這亦證明內質網途徑亦具有一定的Caspase選擇特異性。

2 乳腺癌相關Caspase信號途徑

乳腺癌相關Caspase信號途徑受諸多凋亡調節因子的影響，尤以Bcl-2蛋白家族、TNF超家族、p53、凋亡蛋白抑制因子(IAP)、部分miRNA、人表皮生長因子受體2(HER-2)較多。但在不同途徑中的優勢調節因子不盡相同，且機制各異。

2.1 Caspase相關內源性途徑與乳腺癌 Caspase相關內源性途徑與乳腺癌關系的調節作用主要表現為Bcl-2相關途徑。Talaiezadeh等[18]通過小干擾RNA介導的Bcl-2基因阻斷來處理乳腺癌細胞MCF-7，發現癌細胞生存率顯著降低，并且這一效應在24 h最為明顯，說明了Bcl-2信號通路在乳腺癌的發生、發展中具有重要作用。Bcl-2作為最重要的凋亡調控因子之一，其表達受雌激素(ER)的調節[19]，且研究[20]指出存在ER/PR表達的乳腺癌組織對內分泌抗癌治療較為敏感。同時，黃信等[21]通過對乳腺癌組織中Bcl-2表達的研究亦發現，高表達Bcl-2的乳腺組織往往惡性程度較低，且對內分泌治療方法較敏感，因而具有更為樂觀的預后，并且分析了其原因可能包括：①Bcl-2在抑制凋亡的同時延長了細胞周期，從而在減緩增殖的基礎上減緩了腫瘤基因的變化，使得預后更好；②由于ER陽性乳腺癌對內分泌治療敏感，而Bcl-2的表達又受ER的調節，因此Bcl-2高表達的乳腺癌組織對內分泌調節治療較敏感，且預后較好；③可能由于其他一些如p53、Ki67及表皮生長因子受體等負性調節因子的影響，導致Bcl-2高表達的乳腺癌組織惡性程度通常較低，因而預后更為樂觀；④有可能隨著乳腺癌的發展，某些基因取代了Bcl-2的相關效能，導致Bcl-2低表達的乳腺癌組織惡性程度高而預后較差的結果。

2.2 Caspase相關外源性途徑與乳腺癌 外源性途徑研究中Fas及其相關配體FasL和TNF-R1備受關注。研究[22]發現，Fas及其配體FasL在誘導細胞凋亡的過程中具有重要意義，其中腫瘤FasL在T淋巴細胞的凋亡中就具有重要的誘導作用。李艷萍等[23]研究得出，Fas/FasL的表達與乳腺癌的發生、發展具有一定相關性，隨著乳腺癌病情的發展，Fas蛋白的表達率呈逐漸下降趨勢，而其配體FasL的表達則逐漸升高。同時，許曄瓊等[24]在Fas/FasL基因多態性與乳腺癌發生關系的研究中發現，Fas基因啟動子-1377G>A和-670A>G以及FasL基因啟動子-844T>C基因型的多態性均與乳腺癌的發病具有一定的相關性。另外，TNF-R1作為腫瘤細胞微環境中介導TNF-α效應的主要受體，廣泛存在于正常細胞及多種腫瘤細胞的表面[25]。研究[26]發現，內化的TNF-R1死亡復合物能夠觸發Caspase-8介導的凋亡效應，從而發揮抗炎、抗腫瘤效應。但同時，還有報道[27]稱TNF-R1可以通過激活NF-κB而發揮抗凋亡作用。金蓮錦等[28]通過TNF-R1在乳腺癌中表達的研究發現，TNF-R1在乳腺癌中呈高表達狀態，而在TNF-R1凋亡機制的研究中，當抑制MCF-7細胞中TNF-R1表達時，胞內Caspase-8的表達出現明顯升高，而NF-κB則明顯下降，該結果提示MCF-7細胞中高表達的TNF-R1很有可能通過NF-κB信號途徑的激活抑制了Caspase-8通路的凋亡作用。然而，關于外源性途徑中各因子與乳腺癌發生、發展相關的確切機制還有待進一步研究確定。

3 乳腺癌Caspase信號途徑相關藥物治療

隨著乳腺癌凋亡機制研究的不斷深入，各種藥物的作用機制亦不斷清晰，對于凋亡的調控作用亦更為明了。在目前已知的四條主要凋亡途徑中，幾乎均有Caspase信號途徑的參與。黃茂杰等[29]研究發現，利用乳巖內消霜透皮液干預MCF-10AT細胞可使Bax/Bcl-2比值明顯上升，活化的Caspase-9、Caspase-3及聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的表達亦明顯上調，足以證明乳巖內消霜透皮液很可能通過對上調Bax/Bcl-2促進了細胞色素C的釋放，進而激活Caspase級聯反應，誘發MCF-10AT細胞的凋亡。同時，王俊等[30]發現枸杞總黃酮(TFL)能夠促使MCF-7 細胞中Caspase-3 mRNA的表達逐漸升高，同時使Bcl-2 mRNA逐漸下降，進而通過線粒體凋亡途徑實現MCF-7 細胞的凋亡。吳穎等[31]研究發現，阿司匹林處理乳腺癌AU-565和MDA-MB-231細胞后，可分別促進裂解型Caspase-3和PARP表達的上調，而抗凋亡Bcl-2表達下調，表明Bcl-2/Caspase-3/PARP這一信號通路被激活，調控乳腺癌細胞的凋亡活動。田杰等[32]發現，土槿皮乙酸(PAD)可激活Caspase-8 和Caspase-9凋亡途徑，同時亦可通過P53蛋白誘導人乳腺癌細胞MCF-7走向凋亡。還有研究[33]發現血根堿(SAN)能夠抑制人乳腺癌細胞MCF-7增殖，其機制可能是通過升高細胞內活性氧(ROS)水平激活Caspase級聯反應，進而促進細胞凋亡。樸麗花等[34]研究發現，人參皂甙Rg3可明顯下調腫瘤組織proCaspase-3和proCaspase-9蛋白表達水平，其機制可能為活化癌組織Caspase-3和Caspase-9而誘導細胞凋亡。Won等[35]發現三氧化二砷(As2O3)聯合衣霉素(TM)在誘導人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡方面有協同作用，使TM誘導的ERS細胞凋亡途徑中Caspase-12凋亡通路發生了改變，而TM可逆轉As2O3的促增殖作用為抑制增殖和促進凋亡效應。徐正陽等[36]利用歐前胡素(IMP)上調T-47D細胞中DR5的表達成功促進了腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)誘導的線粒體途徑凋亡。另外，有研究[37]稱銀杏葉提取物(EGB)能增強MCF-7細胞 Caspases-3 蛋白的表達。此外，研究[38-39]發現阿法替尼不但可以通過抑制EGFR/PI3K/AKT通路信號轉導阻滯乳腺癌細胞于G0/G1期，阻斷乳腺癌細胞的增殖，還能促進乳腺癌細胞Caspase-3及PARP的剪切，進而通過Caspase途徑促進細胞凋亡。

4 結 語

雖然目前研究發現對乳腺癌有效的藥物較多，但患者接受治療后的效果卻并非十分理想。因此，在醫療技術不斷發展革新的當下，除了不斷尋找新的治療途徑之外，可能更應該把乳腺癌的治療看作是一個針對整體的治療，最終目的是誘導乳腺癌細胞的加速凋亡。不同凋亡分子途徑之間的相互作用及精準的調控方式將是未來乳腺癌治療研究的重中之重。