乙酰左旋肉堿對脊髓損傷后線粒體的保護作用研究進展

崔 佳，劉敏麗

(延安大學醫學院神經生物學實驗室，陜西 延安 716000)

脊髓損傷是由短時間內機械力直接破壞的原發性原因或原發性損傷基礎上啟動的多種生化反應和多細胞參與的應激反應的繼發性原因所造成的脊髓形態破壞、感覺喪失、所支配的肌肉運動障礙等功能異常的疾病。流行病學研究顯示，2012年美國急性創傷性脊髓損傷的年發病率約54/100萬且在過去10年間保持穩定狀態，其中年輕男性(16～44歲)的發病率呈下降趨勢，而65歲以上老年人的發病率出現了明顯增長[1]。不同于發達國家，中國脊髓損傷年患病率約37/100萬，年齡多在34.7～54.4歲且男性多于女性，主要原因是汽車碰撞和高空墜落[2]。

在脊髓損傷的最初急性期之后，細胞和炎癥反應的級聯作用將導致原發損傷部位周圍神經組織的進行性繼發性損傷，表現為電解質異常、自由基形成、血管缺血、水腫、創傷后炎癥反應、細胞凋亡或遺傳細胞程序性死亡等[3]。作為機制復雜而預后不良的神經系統疾病，脊髓損傷經常出現損傷平面以下感覺、運動及自主神經等功能障礙，給患者帶來極大痛苦。脊髓損傷的修復重點在于對繼發性損傷的調控和治療[4]，臨床上有很多方案，如手術治療、藥物治療(如甲基強的松龍[5])、高壓氧治療[6]、干細胞治療[7]、針刺治療[8]等。目前公認線粒體氧化損傷和誘導細胞凋亡是急性脊髓損傷的重要致病機制，因此保護急性脊髓損傷后受損組織的線粒體成為治療脊髓損傷的關鍵。乙酰左旋肉堿(Acetyl L-carnitine，ALC)是生物體內含量最豐富的左旋肉堿衍生物，其抗炎癥、抗氧化、抗凋亡及促進脂肪代謝等生物學作用可能對脊髓損傷的治療有重要意義。

1 脊髓損傷對線粒體的影響

隨著脊髓損傷時間延長，透射電鏡觀察損傷區域線粒體逐漸出現嵴排列紊亂、嵴腫脹、膜破裂和空泡化，傷后24 h視野內線粒體大小不一，形態不規則，破壞嚴重。脊髓損傷后線粒體膜Na+-K+-ATP酶活性降低，生成ATP逐漸減少，產能受阻，供能不足。脊髓損傷2 h后Caspase-3表達即逐漸增多，介導細胞凋亡，幾乎同時細胞色素C釋放逐漸增加，調控能量代謝和細胞凋亡。脊髓損傷后脊髓組織丙二醛(MDA)水平增高，谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)水平降低，表明線粒體抗氧化水平下降，自由基氧化反應增強，氧化損傷加重。賈志強[9]研究發現，與對照組相比，急性脊髓損傷后線粒體膜電位水平明顯降低。

2 ALC對脊髓損傷后線粒體的保護作用

ALC是生物體內含量最豐富的左旋肉堿乙?；苌铮烊淮嬖谟跈C體，主要合成于哺乳動物的肝臟、腎臟和腦組織中，主要儲存于哺乳動物的肌肉、心臟和骨骼中[10-11]。ALC合成和轉化過程如下：在線粒體內膜上，乙酰輔酶A和左旋肉堿在肉堿乙酰轉移酶的催化下合成ALC，后者通過肉堿/乙酰肉堿?；D位酶進入線粒體基質并轉化為肉堿和乙酰輔酶A，肉堿穿線粒體基質進入線粒體內膜，乙酰輔酶A和膽堿在膽堿乙酰轉移酶催化下生成乙酰膽堿[12]。ALC具有多種生理活性，包括營養作用、神經保護、周圍神經系統止痛、脂肪酸β氧化調節、機體抗氧化調節等。ALC因對治療男性生育能力低下有很好的效果而廣泛應用于臨床，其機制包括促進精子成熟、增加精子運動性、加快精子新陳代謝、促進附睪成熟等[13]。近年來，ALC也開始應用于阿爾茨海默病[14]、帕金森病[15]、抑郁癥[16]以及糖尿病周圍神經病變[17]等疾病，并取得了良好效果。其對線粒體的保護作用主要體現在抑制線粒體介導的氧化應激和細胞凋亡、改善線粒體能量代謝、穩定線粒體膜電位(MMP)、增強線粒體自噬幾個方面。

2.1 抑制線粒體介導的氧化應激 氧化應激反應是機體在受到各種有害刺激時，氧化和抗氧化機制失衡，活性氧類自由基(ROS)和活性氮類自由基等產生明顯增多，造成細胞代謝紊亂和功能異常、蛋白質損傷和脂質過氧化等的過程。ROS產生的主要途徑包括NADPH氧化酶、線粒體、黃嘌呤氧化酶、解偶聯的內皮型NO合酶、環氧合酶和脂氧合酶等[18]。當脊髓損傷導致氧化和抗氧化機制失衡時，線粒體產生的ROS將明顯增多并大量堆積，誘發線粒體氧化損傷，導致線粒體功能障礙。作為抗氧化劑、神經調節劑和神經保護劑，ALC顯示出極好的安全性和耐受性。早在20世紀末，就有很多學者發現了ALC抑制氧化應激的潛在價值。ALC可顯著減弱蛋白質氧化、脂質過氧化和細胞凋亡，其部分可能是通過升高細胞內GSH和熱休克蛋白水平來完成的。趙興長等[19]實驗發現，用ALC處理脊髓損傷的大鼠后，大鼠的 MDA水平明顯降低，SOD活性明顯增加，Caspase-3表達量明顯下降，證實ALC可以通過減輕氧化應激反應來減少神經細胞凋亡，發揮神經保護作用。Wang等[20]研究也支持這一結論。

2.2 抑制線粒體介導的細胞凋亡 細胞凋亡是在凋亡相關基因的調控下，由基因、酶和多種信號轉導通路共同作用的細胞主動有序的死亡過程。凋亡相關基因包括Bcl-2家族、Caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因如p53等，其中Caspase-3是誘導細胞凋亡的重要蛋白酶，是細胞凋亡的重要標志分子。真核細胞主要通過死亡受體、線粒體、穿孔素/顆粒酶和細胞內質網四種通路誘導細胞凋亡[21]。邵海永[22]研究發現大鼠脊髓損傷后6 h即發生細胞凋亡現象并隨時間逐漸增強，還發現脊髓損傷局部細胞大量死亡是由細胞凋亡所致，因此抑制細胞凋亡是保護神經元和修復脊髓損傷的關鍵。Patel等[23]研究發現，ALC可明顯恢復脊髓損傷導致的線粒體功能異常，其機制可能是增強受損線粒體中某些酶的作用，如提高琥珀酸脫氫酶、乙酰輔酶A等的活性。孟慶峰等[24]研究顯示，ALC可增強大鼠脊髓損傷后細胞自噬作用，也能明顯抑制細胞凋亡?？傊?，ALC可有效防止線粒體途徑的細胞凋亡，改善線粒體功能，減輕神經損傷，促進運動功能恢復。

2.3 改善線粒體能量代謝 線粒體作為機體的動力工廠，產生能量供給機體正常生命活動。ALC作為乙酰膽堿的前體，不僅可以調控脂肪酸β氧化釋放能量，也能自身參與三羧酸循環生成ATP。Xu等[25]研究發現，ALC的乙酰基部分可通過大鼠前腦星形膠質細胞和神經元的三羧酸循環代謝為能量，也可與三羧酸循環形成的谷氨酸、谷氨酰胺和γ-氨基丁酸結合，表明發育中的大腦能使用外源性ALC進行能量代謝，ALC作為能量底物在損傷后早期給藥可以提供神經保護，促進腦的氧化供能，減少無氧糖酵解。Ferreira等[12]的研究也得出了類似結論，在成人、新生兒和兒童腦損傷模型中，ALC可以改善機體能量狀態，降低應激反應，并防止后續細胞死亡。有研究進一步發現，ALC可以作用于初級代謝、能量產生，通過氧化和尿素循環促進氨消除，而氨蓄積和能量耗竭似乎是大多數神經毒性事件的基礎，由此證實ALC對中樞神經系統產生了積極影響。

2.4 穩定MMP 正常的MMP是線粒體發生氧化磷酸化、產生ATP的必要條件，一旦出現異常，線粒體就不能進行正常能量代謝和其他正常生命活動，會逐漸導致細胞死亡。MMP下降被認為是細胞凋亡的特征性標志，因此維持正常的MMP是減少細胞凋亡的重要途徑之一[26]。賈志強[9]研究發現，急性脊髓損傷后線粒體膜電位處于下降趨勢。邵海永[22]研究發現，大鼠脊髓損傷后局部會因細胞外液興奮性氨基酸濃度升高而引起Ca2+內流。以上兩種變化都可導致細胞凋亡：MMP下降會導致線粒體內兼有調控能量代謝和細胞凋亡雙重功能的細胞色素C釋放到胞漿中，再通過募集、活化等途徑激活誘導細胞凋亡的重要蛋白酶Caspase-3，從而介導細胞凋亡；Ca2+內流會造成線粒體內Ca2+超載，目前一致認為線粒體Ca2+超載在內源性細胞凋亡途徑中發揮重要的作用，可能與其造成線粒體膜電位消失并通過一系列反應介導線粒體途徑的細胞凋亡有關。多個研究[27]證明ALC對不同方式誘導的線粒體損傷都有保護作用，其中一個方面即是穩定MMP，因此證實ALC可以通過穩定MMP來減少細胞凋亡，保護受損脊髓。

2.5 增強線粒體自噬 線粒體自噬是在自噬相關因子如NIX、ATG1/ULK1、LC3、ATG5、PINK1-Parkin信號通路等的作用下，由細胞形成雙層膜的自噬小體，包裹衰老或損傷的線粒體并與溶酶體結合，再被酸性水解酶降解的過程[28]。標志蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ的值反映細胞自噬情況，是觀察細胞自噬現象、研究自噬活性最可靠的指標。研究[29-30]顯示，大鼠脊髓損傷后胞質內線粒體數目減少、嵴腫脹，粗面內質網松散、有空泡，產生的自噬溶酶體內可見受損的線粒體結構，說明脊髓損傷時的確發生了線粒體自噬。孟慶峰等[24]研究發現，大鼠脊髓損傷后ALC治療組的LC3-Ⅱ表達明顯增強，細胞凋亡較對照組明顯減少，說明ALC不僅提高了大鼠脊髓損傷后細胞自噬水平，也抑制了細胞凋亡。因此，增強脊髓損傷后線粒體自噬水平是減少神經細胞凋亡的有效途徑。也有學者認為，脊髓損傷發生過程中，可能是MMP降低或能量缺乏啟動了線粒體自噬，清除胞漿中損傷的線粒體和其他異常分子，維持細胞內環境穩態。雖然具體機制還不清楚，但ALC確實可以通過促進大鼠急性脊髓損傷后細胞自噬和抑制細胞凋亡來減輕神經損傷，促進運動功能恢復。

3 結 語

脊髓損傷是中樞神經系統的一種嚴重創傷，已有大量研究表明保護線粒體是治療脊髓損傷的中心環節。ALC通過抑制線粒體介導的氧化應激反應和細胞凋亡、改善線粒體能量代謝、穩定MMP、增強線粒體自噬等途徑來保護線粒體。以上途徑是相輔相成的，ALC多層次、多角度地作用于線粒體，保證線粒體的正常生命代謝活動和功能，但其最終通路都是通過抑制細胞凋亡來減輕神經損傷，維持內環境穩態。鑒于ALC優秀的線粒體保護作用，其可能會在未來脊髓損傷的臨床治療中發揮積極作用，但其具體機制和劑量應用等方面還有賴于更多的實驗驗證。