磷脂酶D1促進非酒精性脂肪肝體外模型的脂肪生成

楊 丹， 孫 波， 崔振宇， 蔣 杰， 楊文卓

(1. 同濟大學醫學院，上海 200092； 2. 同濟大學附屬同濟醫院消化科，上海 200065)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是臨床上較為常見的一類與肥胖、2型糖尿病、血脂異常密切相關的以肝細胞內脂質沉積為特征的肝臟疾病，包括單純性非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver, NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)、NASH相關肝纖維化及肝硬化和肝細胞癌[1]。近年來，NAFLD的全球患病率越發升高，全球的患病率約為24.24%，其中南美洲(30.34%)和中東(31.37%)報告的患病率最高，亞洲(27.37%)的患病率僅次之[2]。我國近年來NALFD患病率迅速增長，流行病學顯示其患病率高達12.5%～38.17%，已成為我國慢性肝病最常見的原因[3-6]。目前該病的發病理論機制復雜，多種理論[7]如二次打擊學說、多次打擊學說、腸道菌群失調、脂質異位沉積等學說的提出都只是冰山一角，該病完整的病因機理學說仍未建立。

磷脂酶D(phospholipase D, PLD)是一類催化磷酸二酯鍵的酶，催化水解磷脂酰膽堿，生成磷脂酸(phosphatidic acid, PA)和膽堿[8]。PA是細胞內重要的脂質第二信使，也是其他脂質信號分子的前體，包括二酰基甘油(diacylglycerol, DAG)和溶血磷脂酸(lysobisphosphatidic acide, LPA)[8-9]。PA、LPA和DAG對多種細胞通路有影響，包括細胞內囊泡運輸，內吞作用，胞吐作用，肌動蛋白細胞骨架動力學，細胞增殖、分化，遷移和存活[10]。有研究[11]表明，PLD1激活可促進葡萄糖轉運體4(Glut4)的轉運與葡萄糖的攝取，通過siRNA干擾選擇性沉默PLD1表達可抑制Glut4的易位，與胰島素抵抗有關，此外，發現PLD參與脂質滴的產生和成脂分化[12-13]。糖、脂代謝異常在NAFLD的發生發展中起著重要作用，推測PLD1可能與NAFLD有著千絲萬縷的聯系，但到目前為止，尚無研究表明它們之間的確切關聯。本研究旨在觀察磷脂酶D1對非酒精性脂肪性肝病體外細胞模型成脂作用的影響，探討PLD1對非酒精性脂肪性肝病成脂作用的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人肝癌細胞系HepG2購自中國上海中科院細胞庫。DMEM細胞培養基購自美國Sigma公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum)購自澳洲CellSera公司；青霉素、鏈霉素、PBS、BSA購自江蘇凱基生物技術有限公司；油酸、棕櫚酸、油紅O染料、尼羅紅染料、DMSO購自美國Sigma公司；LipofectamineTM2000購自美國Thermo公司；CCK-8檢測試劑盒購自蘇州新賽美生物科技有限公司；si-PLD1 RNA購自吉瑪基因有限公司；Ad-PLD1慢病毒過表達載體購自上海諾百生物科技有限公司；RNAfast200抽提試劑盒購自上海飛捷生物技術有限公司；逆轉錄PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、qRT-PCR TB Green Premix Ex TaqⅡ試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 HepG2細胞用含10%FBS和1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養液于37℃、含5% CO2培養箱中培養。將細胞以1×105個/mL密度接種到6孔板中，培養24h后的細胞用于后續實驗。將細胞分為空白對照組、FFA模型對照組、si-PLD1干預組、si-PLD1+FFA模型干預組、Ad-PLD1干預組、Ad-PLD1+FFA模型干預組。

1.2.2 FFA處理 接種HepG2細胞待細胞完全貼壁后，用PBS洗1次后更換培養液為不含FBS、含1mmol/L FFA(棕櫚酸∶油酸摩爾濃度比例=2∶1)的DMEM培養液，處理24h后用于后續實驗。

1.2.3 CCK-8檢測FFA對細胞毒性 取對數生長期的HepG2細胞，以每孔5000個細胞的密度接種于96孔板中。待細胞完全貼壁后加入含1mmol/L FFA的DMEM培養液，同時設置不含FFA的對照組，每組設6個復孔，培養24h后棄培養液，加入含CCK-8試劑的培養液，2h后用酶標儀檢測450nm出的吸光度(A450)值。

1.2.4 油紅O染色 空白對照組和FFA模型對照組細胞用FFA處理24h后，棄培養液，用PBS洗1～3次后加入4% PFA固定細胞10min，棄4% PFA，PBS洗1～3次后加入油紅O工作液避光孵育15～20min，棄油紅O染液，PBS洗1～3次后加入蘇木精染核30s。

1.2.5 細胞轉染 轉染前1d，取處于對數生長期的HepG2細胞，按以1×105個/mL密度接種到6孔板中，待細胞完全貼壁后，用PBS清洗1次，加入含10%FBS的DMEM培養液。si-PLD1 RNA的轉染濃度為100nmol/L。將siRNA+optimem和Lipo-2000+optimem孵育5min，再將孵育完畢的siRNA和Lipo-2000混勻后孵育15～20min，孵育完畢后將混合液加入培養板中，輕輕混勻，將培養板放入37℃、含5% CO2培養箱中培養24h。

1.2.6 病毒感染 病毒感染前1d，取處于對數生長期的HepG2細胞，按以2×105個/mL密度接種到12孔板中，待細胞融合度約為50%后，更換培養液，取慢病毒液按MOI值=100稀釋加入到培養液中，如有必要加入聚凝胺(polybrene)至終濃度 5～10μg/mL。將培養板放入37℃、含5% CO2培養箱中培養4～6h 后，吸去含病毒的培養液，用正常培養液小心洗細胞2～3次，加入含10%FBS的DMEM培養液培養48h。

1.2.7 流式細胞術檢測平均熒光強度 各組HepG2細胞處理后，棄培養液，用PBS洗1～3次后加入胰酶消化。終止消化后吹打至細胞懸液后收集至離心管，離心半徑8.5cm，1000r/min，離心 5min，棄上清液；加入PBS重懸細胞，離心半徑 8.5cm，1000 r/min ，離心5min，棄上清液，重復1～3次；加入4% PFA固定細胞5min；離心半徑8.5cm，1000r/min，離心5min，棄上清液；加入PBS重懸細胞，離心半徑8.5cm，1000 r/min，離心5min，棄上清液，重復1～3次；加入0.75μg/mL尼羅紅染液，避光孵育 15min 后用流式細胞儀檢測各組細胞平均熒光強度。

1.2.8 RT-qPCR檢測細胞中PLD和成脂相關基因mRNA的表達 用RNA抽提試劑盒提取處理完的細胞總RNA，檢測純度后反轉錄為cDNA。以cDNA為模板、β-actin為內參進行實時熒光定量PCR，反應體系為10μL。反應程序： 95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s，40個循環；引物序列見表1。用2-ΔΔCt的方法計算各基因相對表達量。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 構建非酒精性脂肪肝體外細胞模型

將細胞分為空白對照組和FFA模型對照組，1mmol/L FFA處理模型對照組24h后，行油紅O染色，結果示模型對照組細胞內脂滴明顯聚集。通過Image J量化分析空白對照組和FFA模型對照組脂滴形成情況，結果示FFA模型對照組脂滴相較于空白對照組的脂滴面積明顯增多，可達10.28倍，差異有統計學意義(P<0.001)。說明1mmol/L FFA處理HepG2細胞24h可成功構建非酒精性脂肪肝體外細胞模型，見圖1。

表1 用于實時熒光定量PCR的基因引物序列

圖1 油紅O染色HepG2細胞內脂滴情況(×200)Fig.1 Oil red staining of lipid droplets in HepG2 cells(×200)

2.2 FFA毒性檢測

將細胞分為正常對照組和FFA模型對照組，FFA處理細胞24h后，CCK-8檢測結果顯示，FFA對HepG2細胞沒有毒性作用，相反，FFA能促進HepG2細胞生長，FFA模型對照組的細胞活力是空白對照組的1.27倍，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3 PLD在非酒精性脂肪肝體外模型中的表達

將細胞分為空白對照組和FFA模型對照組，通過RT-qPCR檢測PLD1和PLD2 mRNA的表達水平。結果顯示，FFA模型對照組相較于對照組的PLD1 mRNA和PLD2 mRNA表達水平均降低，且PLD1 mRNA表達降低差異有統計學意義(P<0.05)，PLD2 mRNA變化差異無統計學意義，見圖2。因此推測細胞內脂滴聚集和PLD1有關。

圖2 FFA處理前后HepG2細胞中PLD1和PLD2的表達Fig.2 Expression of PLD1/PLD2 in HepG2 cells after FFA treatment 與對照組相比，*P<0.05

2.4 PLD1 siRNA對非酒精性脂肪肝體外模型脂滴形成程度的影響

以PLD1為靶標，用si-PLD1小干擾RNA沉默PLD1基因，以觀察PLD1對脂滴形成的影響。si-PLD1 RNA轉染細胞24h后，行油紅O染色，結果顯示空白對照組和si-PLD1對照組都無明顯脂滴形成，且細胞生長良好，si-PLD1 RNA未對細胞生長產生明顯影響，見圖3。

圖3 空白對照組和si-PLD1對照組細胞內脂滴情況(×400)Fig.3 Oil red staining of lipid droplets in the normal control group and the si-PLD1 control group(×400)

si-PLD1 RNA轉染細胞24h后，si-PLD1對照組相比空白對照組PLD1 mRNA的表達水平顯著降低(P<0.001)，si-PLD1+FFA模型干預組相比FFA模型對照組PLD1的表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖4。表明si-PLD1 RNA的沉默效果明顯。

圖4 si-PLD1 RNA轉染后HepG2細胞中PLD1的表達Fig.4 Expression of PLD1 in HepG2 cells after si-PLD1 RNA transfection 與對照組相比，**P<0.01，n=3

流式細胞術檢測結果顯示，FFA模型對照組較正常對照組平均熒光強度增加(P<0.001)；而si-PLD1+FFA模型干預組較FFA模型對照組平均熒光強度明顯降低(P<0.001)，見圖5。說明FFA處理HepG2細胞24h后，細胞內脂滴聚集顯著增多，非酒精性脂肪肝體外細胞模型構建成功；且siRNA沉默PLD1后細胞內的脂滴可明顯減少，說明si-PLD1能抑制細胞內脂滴生成。

圖5 si-PLD1 RNA轉染后HepG2細胞 尼羅紅染色的平均熒光強度Fig.5 Mean fluorescence of Nile Red stained of HepG2 cells after si-PLD1 RNA transfection 與對照組相比，**P<0.01，n=3

2.5 PLD1 siRNA對非酒精性脂肪肝體外模型中成脂基因的影響

為探究PLD1影響HepG2細胞的脂滴形成的機制，本研究檢測了成脂基因FASN、DGAT2和GPAT4 mRNA的表達水平。結果顯示，FFA模型對照組相比空白對照組FASN mRNA水平明顯增加(P<0.05)，而si-PLD1+FFA模型干預組較FFA模型對照組mRNA水平明顯降低(P<0.01)。FFA模型對照組相比空白對照組DGAT2 mRNA水平明顯增加(P<0.01)，si-PLD1+FFA模型干預組較FFA模型對照組mRNA水平明顯增加(P<0.05)。GPAT4結果顯示，FFA模型對照組相比空白對照組mRNA水平明顯降低(P<0.01)，si-PLD1+FFA模型干預組較FFA模型對照組mRNA水平也明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖6。

2.6 Ad-PLD1過表達對非酒精性脂肪肝體外模型脂滴形成程度的影響

用Ad-PLD1過表達PLD1基因的慢病毒感染HepG2細胞，以觀察PLD1對脂滴形成的影響。Ad-PLD1慢病毒感染細胞24h后，行油紅O染色，結果顯示空白對照組和Ad-PLD1對照組都無明顯脂滴形成，細胞生長良好，Ad-PLD1慢病毒未對細胞生長產生明顯影響，見圖7。

Ad-PLD1慢病毒感染細胞48h后，用1mmol/L FFA處理細胞24h。qRT-PCR檢測結果顯示，Ad-PLD1對照組相比空白對照組PLD1的表達水平顯著升高，可達4.88倍(P<0.001)，Ad-PLD1+FFA模型干預組相比FFA模型對照組PLD1的表達水平也顯著升高(P<0.001)，Ad-PLD1的過表達效果明顯，見圖8。

圖6 si-PLD1 RNA轉染后HepG2細胞成脂基因的mRNA表達水平Fig.6 Expression of adipogenesis genes in HepG2 cells after si-PLD1 RNA transfection 與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=4

收集細胞行尼羅紅染色，流式細胞術檢測結果顯示，FFA模型對照組較正常對照組平均熒光強度增加(P<0.001)，且Ad-PLD1+FFA模型干預組較FFA模型對照組平均熒光強度明顯增加(P<0.001)，見圖9。說明FFA處理HepG2細胞24h后，細胞內脂滴聚集顯著增多，非酒精性脂肪肝體外細胞模型構建成功；且Ad-PLD1過表達PLD1后細胞內的脂滴可明顯增多，說明Ad-PLD1可促進細胞內脂滴生成。

2.6 Ad-PLD1過表達對非酒精性脂肪肝體外模型中成脂基因的影響

qRT-PCR結果顯示，FFA模型對照組相比空白對照組FASN mRNA水平明顯增加(P<0.05)，且Ad-PLD1+FFA模型干預組較FFA模型對照組mRNA水平明顯增加(P<0.05)。DGAT2結果示： FFA模型對照組相比空白對照組mRNA水平明顯增加(P<0.01)，而Ad-PLD1+FFA模型干預組較FFA模型對照組mRNA水平明顯降低(P<0.01)。GPAT4結果示，FFA模型對照組相比空白對照組mRNA水平明顯降低(P<0.01)，Ad-PLD1+FFA模型干預組較FFA模型對照組mRNA水平也明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖10。

圖7 空白對照組和si-PLD1對照組 細胞內脂滴情況(×400)Fig.7 Oil red staining of lipid droplets in the normal control group and the si-PLD1 control group(×400)

圖9 Ad-PLD1慢病毒感染后HepG2細胞 尼羅紅染色的平均熒光強度Fig.9 Mean fluorescence of Nile Red stained of HepG2 cells after Ad-PLD1 lentivirus infection 與對照組相比，**P<0.01，n=4

圖10 Ad-PLD1慢病毒感染后HepG2細胞成脂基因的mRNA表達水平Fig.10 Expression of adipogenesis genes in HepG2 cells after Ad-PLD1 lentivirus infection 與對照組相比，*P<0.05,**P<0.01,n=4

3 討 論

目前有多種理論來解釋NAFLD的發病，但其完整發病機制尚不明確，其中值得肯定的是胰島素抵抗和脂代謝紊亂在NAFLD發病中始終發揮著至關重要的作用[14]。盡管PLD1在癌癥、感染和神經退行性疾病中的作用已被探究的相當深入[9,15-16]，但PLD1與NAFLD之間的關系尚仍不清楚。據報道，PLD1可通過增強ERK2誘導的動力蛋白磷酸化來調節脂滴形成[17-18]，PLD1的過表達可促進脂質滴的形成，而使用siRNA抑制PLD1的表達則可抑制脂質滴的形成，這與本研究結果相一致。此外，還有報道表明PLD1通過mTOR-IRS-1絲氨酸636/639的磷酸化調節成脂分化[19-20]。PLD1可通過調節其與PED/PEA15相互作用來調節葡萄糖轉運[21-22]，進而影響胰島素抵抗。近年來有基于計算機模擬的研究，從PLD1和PED/PEA15中篩選了線性肽段，證明該肽可作為競爭性抑制劑中斷PLD1-PED/PEA15的相互作用，從而恢復胰島素刺激的葡萄糖攝取[23]。

本研究通過構建si-PLD1 RNA沉默PLD1基因和構建Ad-PLD1慢病毒過表達PLD1基因，來研究PLD1在NAFLD體外細胞模型中對成脂的影響。本研究有充分的證據表明，PLD1參與HepG2細胞的細胞內脂肪生成；沉默PLD1后，細胞內脂滴減少，且可在FFA誘導的FASN上調基礎上下調FASN；而過表達PLD1后，細胞內脂滴增多，可在FFA誘導的FASN上調基礎上繼續上調FASN。因此推斷，PLD1參與肝臟脂肪生成，并可促進肝臟脂肪生成。但值得注意的是，沉默PLD1可使FFA誘導上調的DGAT2進一步上調，而使FFA誘導下調的GPAT4進一步下調。二酰基甘油酰基轉移酶2(DGAT2)催化甘油三酸酯合成的最后一步，甘油3- 磷酸酰基轉移酶4(GPAT4)是將甘油-3-磷酸轉化為1-酰基-sn-甘油-3-磷酸(溶血磷脂酸或LPA)的關鍵一步，這意味著沉默PLD1可使細胞內三酰甘油增加，而溶血磷脂酸減少。而PLD1過表達結果則與沉默PLD1后的結果相反。

三酰甘油是NAFLD患者肝臟中儲存的主要脂質，曾經被認為是引起脂毒性的主要原因，但現有研究證據更加支持甘油三酸酯可能發揮保護作用[24]，根據脂毒性學說的觀點，肝細胞內的三酰甘油并不會導致胰島素抵抗和肝細胞損傷，真正引起NASH的核心機制是游離脂肪酸及其代謝產物如膽固醇、棕櫚酸、溶血磷脂酰膽堿和神經酰胺等非三酰甘油的脂毒性肝損害，包括內質網應激[25]、炎癥[26]、細胞凋亡、壞死和畸形等，而三酰甘油脂滴則作為一種平行現象，甚至是對肝細胞的一種保護現象[27-29]。在本研究中，沉默PLD1使溶血磷脂酸減少，而三酰甘油保護性增加，這和脂毒性學說一致。相反，過表達PLD使溶血磷脂酸增多，而三酰甘油卻有所減低。這表明，雖然PLD1能促進肝細胞內脂肪生成，但似乎并不是一個保護性因素，PLD1具體在NAFLD中扮演著什么角色，還有待進一步探究。

本研究初步探究了PLD1在NAFLD體外細胞模型中對脂肪生成的影響。已經確定，沉默PLD1可使NAFLD細胞模型中的脂滴減少，而過表達PLD1可使NAFLD細胞模型中的脂滴增多。這些發現表明PLD1可能在NAFLD的發生和發展中起著至關重要的作用，且PLD1可能是預防和治療NAFLD的新靶標。下一步本課題組將在動物體內進一步驗證PLD1和NAFLD的關聯，探究PLD抑制脂滴生成的相關機制，盡可能為非酒精性脂肪性肝病尋找新的治療靶點。