黃連素下調細胞周期蛋白依賴性激酶-2活性抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心肌纖維化

姜學澤， 陳宇涵， 陳友銘， 王岳鵬

(上海交通大學醫學院附屬新華醫院心內科，上海 200092)

心肌纖維化是多數心臟疾病的共同病理表現，其主要特征是心臟成纖維細胞大量分化、增殖以及細胞外基質的過度沉積[1-2]。心肌纖維化可導致心力衰竭，同時也改變心臟電傳導而引起心律失常[3-4]。其主要病理發生機制涉及心臟成纖維細胞過度分化及增殖。目前臨床上治療心肌纖維化的方法匱乏且療效甚微。在傳統中醫藥中，黃連用作藥材的歷史可以追溯到公元200年中醫藥經典《神農本草經》。黃連素是從黃連中分離的異喹啉化合物的主要成分[5]，具有抗微生物、抗真菌和抗炎的性能。近年來研究提示其對高脂血癥、高血糖癥、高血壓、神經退行性疾病及腫瘤等有治療效果[6-11]。有動物實驗[12]表明，黃連素可下調糖尿病大鼠心臟成纖維細胞中胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor-1 receptor, IGF-1R)的表達并隨后降低心臟中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)-2/MMP-9、α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和 Ⅰ 型膠原(collagen)的表達來改善心肌纖維化和功能障礙，從而對糖尿病大鼠起到心臟保護作用。Che等[13]通過體內及體外實驗證實，黃連素可以減少巨噬細胞浸入經異丙腎上腺素刺激的大鼠心肌，并抑制轉化生長因子(trans-forming growth factor, TGF)-β1/smads信號通路阻止成纖維細胞轉化為“激活的”分泌型肌成纖維細胞，從而對心臟損傷起到保護作用。這些實驗表明，黃連素可能有抑制心肌纖維化的作用。本課題組利用蛋白磷酸化質譜篩選到黃連素對心肌細胞的細胞周期蛋白依賴性激酶-2(cyclin-dependent protein kinases-2, CDK2)有顯著抑制作用。CDK2是細胞外分裂原刺激后通過細胞內絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)通路下游的調節細胞周期從G1期到S期的關鍵調節蛋白。大量前期研究表明，CDK2的活性對調節心臟成纖維細胞的分化及增殖至關重要，其主要激活位點為Thr-160[14-17]，因此設想黃連素可能通過抑制CDK2-T160磷酸化來抑制心臟成纖維細胞增殖，從而達到抑制心肌纖維化的目的。本研究在體內和體外探討黃連素對心肌纖維化的作用，以及是否通過抑制CDK2活性起作用，從而為臨床治療心肌纖維化提供新的藥物及作用靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

野生型SD大鼠及乳鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司；植入式膠囊滲透壓泵(2ML4)購自美國Alzet公司；血管緊張素 Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang-Ⅱ)、黃連素(berberine，BBR)等購自美國Sigma公司；小動物無創血壓儀購自美國Vistech Systems公司；DMEM高糖培養基、DMEM低糖培養基、PBS粉末、Ⅱ型膠原蛋白酶、0.25%胰酶(含0.02%EDTA)、Hanks緩沖溶液(10×HBSS)、胎牛血清購自美國Gibco公司；L-谷氨酰胺(L-glutamine)、青霉素-鏈霉素溶液、磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)、凍存用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)等購自上海生工生物工程有限公司；CCK-8試劑盒、anti-GAPDH、anti-mouse IgG HRP、anti-rabbit IgG HRP等購自上海碧云天生物科技有限公司；anti-CDK2、anti-phosphate-CDK2-T160、anti-Cyclin D1、anti-Collagen Ⅰ、anti-Collagen Ⅲ、anti-Vimentin及anti-α-SMA等購自上海優寧維生物科技有限公司；CDK2-T160A及CDK2-T160D腺病毒包裝由上海漢恒生物有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠心肌纖維化模型制作 將4～5周齡體重約180g野生型雄性SD大鼠共24只隨機分為4組(n=6)： 空白對照組(Ctl)、血管緊張素組(Ang-Ⅱ)、低劑量黃連素組(Low BBR)及高劑量黃連素組(High BBR)。Ctl組植入膠囊滲透壓泵，注入0.9%氯化鈉溶液2mL，其余3組滲透壓泵內用注射器按照500ng/(kg·min)灌注速度注入Ang-Ⅱ溶液2mL。腹腔注射5%水合氯醛水溶液1～2mL 麻醉SD大鼠，用剃須刀將大鼠背部皮膚除毛，75%酒精棉球局部消毒后，用剪刀縱向剪開大鼠背部皮膚，并鈍性分離至皮下，按組別分別埋入0.9%氯化鈉及Ang-Ⅱ滲透壓泵(釋放速度2.5μL/h)，縫合皮下組織及皮膚。術后Ctl組及Ang-Ⅱ組每日用灌胃方式灌入1.5mL蒸餾水，Low BBR組及High BBR組按照10mg/(kg·d)及 60mg/(kg·d)灌胃灌入1.5mL黃連素蒸餾水混懸液，共計28d。每只大鼠每3d測定鼠尾血壓，每次測量至少5次，取平均值，以大鼠收縮壓>140mmHg(1mmHg=0.133kPa)并結合心臟超聲及Masson病理染色確定大鼠心肌纖維化模型制作成功。

1.2.2 大鼠心臟超聲檢查 用Vevo2100小動物超聲成像平臺進行大鼠心臟超聲檢查，評價各組實驗大鼠的心臟結構及功能。探頭頻率21MHz，采用M型超聲分別測定各組大鼠心動周期5次以上，取平均值，分別測量左室舒張期末后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness at end-diastole, LVPWTD)、室間隔厚度(interventricular septal thick-ness at diastole, IVSD)、左室收縮期末內徑(left ventricular end-systolic diameter, LVESD)、左室舒張期末內徑(left ventricular end-diastolic diameter, LVEDD)、左室收縮期末容積(left ventricular end-systolic volume, LVESV)、左室舒張期末容積(left ventricular end-diastolic volume, LVEDV)、左室心肌質量(left ventricular mass, LV_mass)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)、左心室射血分數(left ventricular ejection fraction, LVEF)等。

1.2.3 心臟組織病理染色 大鼠麻醉過量致死后，立即剖開胸腔取出心臟，稱重，取左心室中部組織冠狀切面，用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，切片，行Masson及H-E染色，于倒置顯微鏡下觀察心肌纖維化程度并拍照。

1.2.4 心臟組織總蛋白提取 取10mg大鼠心臟心室組織，液氮低溫下研磨組織，加入100μL RIPA裂解液及2μL苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)，冰上勻漿30min，轉移至1.5mL離心管，于4℃下10000×g離心15min，取上清液，分裝保存，行Western印跡法檢測。

1.2.5 心臟成纖維細胞的分離、培養及鑒定 選取1～3d SD大鼠乳鼠，5%水合氯醛腹腔麻醉后，無菌狀態下開胸取出心臟，盛裝在PBS中轉移至超凈臺，PBS清洗后剪碎切成小于1mm3的小塊，在4℃下于含有0.5%胰蛋白酶的D-Hanks平衡鹽溶液中孵育過夜，收集小塊，并通過Ⅱ型膠原酶(100μ/mL)在37℃ 下進一步消化40min，用含有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM終止消化，重懸后通過200目的濾網過濾，鋪板在含有10%FBS的DMEM的培養皿中孵育70min，棄上清液后收集附著在底部的剩余細胞，重懸后重新鋪板，補充含有10%FBS、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM培養基，后每48h更換1次完全培養基，待細胞生長至融合狀態時，以1∶2比例傳代，選取第3～4代細胞進行實驗。待細胞生長至80%融合狀態時,去除培養基，用PBS反復沖洗細胞3次,加入2mL PBS，顯微鏡觀察及獲取照片,行免疫熒光波形蛋白(Vimentin)染色及α-SMA染色后熒光顯微鏡下觀察鑒定成纖維細胞。

1.2.6 細胞毒性測定(CCK-8) 配置每100μL 5000 個細胞的成纖維細胞懸液，加入96孔板，37℃、5% CO2培養箱預培養24h，PBS沖洗后向培養孔中加入100μL含不同終濃度(0、3、10、30、100、300、1000、3000 μmol/L)的黃連素完全培養基，繼續孵育培養24h 后，每孔加入10μL CCK-8溶液，孵育1～4h，每小時用酶標儀測定在450nm處的光密度值(A450)。

1.2.7 心臟成纖維細胞纖維化模型構建 選取第3～ 4代心臟成纖維細胞，待細胞密度達到50%～60%時，將細胞分為4組，正常對照組(Ctl組)： 培養基不加藥物干預；Ang-Ⅱ對照組(Ang-Ⅱ組)： 培養基加入Ang-Ⅱ(終濃度1μmol/L)；低濃度黃連素組(Low BBR組)： 培養基加入Ang-Ⅱ(終濃度1μmol/L)+黃連素(終濃度20μmol/L)；高濃度黃連素組(High BBR組)： 培養基加入Ang-Ⅱ(終濃度1μmol/L)+黃連素(終濃度200μmol/L)。分別放入培養箱中培養24、48h后觀察細胞形態、生長速度。

1.2.8 細胞增殖檢測(CCK8) 按照成纖維細胞纖維化模型分組，將100μL心臟成纖維細胞懸液加入96孔板中，在培養箱37℃、5% CO2預培養24h后，按照前述心臟成纖維細胞纖維化模型分組向培養孔中加入含相應濃度藥物的培養基，繼續孵育培養24～48h后，向每孔加入10μL CCK-8溶液，孵育1～4h，每小時用酶標儀測定在450nm處的吸光度值(A450)。

1.2.9 流式細胞儀檢測細胞增殖周期 經藥物處理過的細胞用PBS洗滌后加入胰酶消化，收集細胞，PBS清洗2次，離心后棄上清液，加入1mL PBS渦旋成細胞懸液，逐滴加入預冷的100%乙醇配成75%左右的乙醇溶液，-20℃避光過夜，200×g離心細胞10min，棄上清液，PBS清洗細胞2次后，加入含100μg/mL核糖核酸酶A(RNase A)和50μg/mL碘化丙啶(propidium， PI)的PBS后重懸細胞，37℃孵育30min，300目的尼龍膜過濾后流式細胞儀(美國，Thermo)檢測細胞增殖周期分布。

1.2.10 成纖維細胞總蛋白提取 將藥物處理過的細胞用PBS清洗2次后加入200μL RIPA裂解液及4μL PMSF，冰上裂解30min，轉移至1.5mL離心管于4℃下10000×g離心15min，取上清液，分裝保存及行Western印跡法檢測。

1.2.11 CDK2-T160A及CDK2-T160D腺病毒包裝、感染心臟成纖維細胞 將狀態良好的細胞按照每孔5×105個細胞接種到12孔板，預培養24h后，吸去原有培養基，加入完全培養基，按照MOI=50將融化后的2種腺病毒加入細胞中，混勻后放入培養箱37℃感染4h，更換新鮮培養基37℃培養24～36h，每組均加入Ang-Ⅱ(終濃度1μmol/L)后，加入黃連素(終濃度為20μmol/L及200μmol/L)處理細胞，與未加黃連素的對照組細胞同時放入培養箱繼續培養24～48h，觀察細胞形態、生長速度。

1.2.12 Western印跡法檢測 用BCA法測定組織及細胞總蛋白濃度，滴定各組蛋白至統一濃度，加入上樣緩沖液，煮沸5min，取20μL蛋白質樣品行12.5% SDS-PAGE電泳，將蛋白轉入PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1h，TBST緩沖液漂洗3次后，加入1∶1000稀釋的一抗封膜，4℃搖床過夜，TBST漂洗3次后加入1∶1000稀釋的二抗室溫搖床孵育1h，TBST漂洗膜3次，加入發光液后立即于化學發光成像儀(Las 4000 Mini)發光并采集圖像。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 黃連素減輕Ang-Ⅱ引發的大鼠心臟功能不全

心臟超聲心動圖可顯示心臟腔內結構及心功能，在SD大鼠心肌纖維化模型中，經Ang-Ⅱ作用28d后，心超檢查結果Ang-Ⅱ組大鼠LVPWT、IVSD、LV_mass及LVFS較Ctl組大鼠均有明顯增加(P<0.01)，LVEF明顯降低(P<0.01)，見圖1。處死大鼠后取出心臟測量心臟和體重比(heart weight/body weight, HW/BW)明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。表明經Ang-Ⅱ刺激后大鼠心臟呈向心性肥厚，并存在心功能不全。而經過黃連素治療后，相對于Ang-Ⅱ組，LVPWT、IVSD、LV_mass、LVFS及HW/BW均明顯下降(P<0.01)，LVEF明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)，并與Ctl組相接近。而低劑量的黃連素和高劑量的黃連素治療效果相比，除LVPWT及HW/BW差異有統計學意義(P<0.01)外，IVSD、LV_mass、LVFS及LVEF差異不顯著，見表1。而心室組織行H-E染色后，計算心肌細胞橫截面積顯示Ang-Ⅱ可誘發心肌細胞肥大(P<0.01)，而黃連素顯著逆轉Ang-Ⅱ的這種作用(P<0.01)，見圖2。

2.2 黃連素減輕Ang-Ⅱ致大鼠心肌纖維化

大鼠心室組織切片后行Masson及H-E染色，計算纖維化面積比值，結果顯示Ang-Ⅱ組相較于Ctl組大鼠心肌纖維化程度明顯增加(P<0.01)，而經黃連素處理后明顯減輕Ang-Ⅱ誘導的心肌纖維化(P<0.01)，高劑量黃連素組降低得更加明顯(P<0.01)，見圖2A、C。提取心室組織行Western印跡法檢測心肌纖維化標志物，結果顯示與Ctl組相比，Ang-Ⅱ明顯增加心臟組織Collagen Ⅰ/Ⅲ的表達(P<0.01)，經黃連素處理后顯著降低Ang-Ⅱ誘發的Collagen Ⅰ/Ⅲ的表達(P<0.05)，高劑量黃連素處理組降低得更顯著(P<0.01)，見圖3。

圖1 黃連素減輕Ang-Ⅱ引發的大鼠心臟向 心性肥厚及心功能不全Fig.1 Berberine attenuates angiotensin Ⅱ-induced cardiac hypertrophy and cardiac dysfunction in rats

表1 各組大鼠心臟和體重比值以及心超檢查結果

圖2 黃連素抑制Ang-Ⅱ誘導的心肌纖維化Fig.2 Berberine inhibits angiotensin Ⅱ-induced cardiac fibrosisA： 各組心室組織行Masson染色，觀察纖維化程度，計算各組纖維化面積比值；B： 各組心室組織行H-E染色，觀察心肌細胞，計算心肌細胞橫截面積；C： 各組心室組織纖維化面積比值比較，**P<0.01；D： 各組心肌細胞橫截面積比較，**P<0.01

2.3 黃連素通過下調CDK2活性抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心肌纖維化

大鼠心室組織提取總蛋白后行Western印跡法檢測，結果顯示，Ang-Ⅱ 明顯上調CDK2-T160磷酸化水平(P<0.01)及Cyclin D1表達(P<0.05)，高劑量黃連素處理組的大鼠心肌細胞CDK2-T160磷酸化水平及Cyclin D1表達較Ang-Ⅱ組均明顯降低(P<0.05)，與空白對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)，而低劑量黃連素處理組僅Cyclin D1有明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，CDK2-T160磷酸化水平下降不是很明顯(P>0.05)，見圖3。

2.4 心臟成纖維細胞鑒定及黃連素對細胞毒性測定

在倒置顯微鏡下觀察分離培養的心臟成纖維細胞呈梭形或多角形，細胞核呈橢圓形，胞體較大，細胞排列緊密，不易聚集成團，無自主搏動。Vimentin染色為陽性，α-SMA染色為弱陽性，細胞計數表明所分離培養的細胞98%以上為心臟成纖維細胞[18]，見圖4A。CCK8毒性測定結果提示黃連素對細胞毒性呈濃度依賴型，經統計學分析和計算，IC50=177μmol/L，見圖4B。

圖3 黃連素通過下調CDK2活性抑制 Ang-Ⅱ誘導的心肌纖維化Fig.3 Berberine inhibits angiotensin Ⅱ-induced cardiac fibrosis by inactivation of CDK2A： Western印跡法檢測CDK2-T160蛋白磷酸化、CDK2總蛋白表達量、Cyclin D1蛋白表達量、Collagen Ⅰ/Ⅲ蛋白表達量；B： 各組目標蛋白與GAPDH條帶灰度值比較，及p-CDK2-T160與T-CDK2灰度值比值比較；*P<0.05；**P<0.01

2.5 黃連素抑制Ang-Ⅱ誘導的心臟成纖維細胞增殖

分離培養的心臟成纖維細胞經Ang-Ⅱ及不同濃度的黃連素處理24～48h后，采用CCK8檢測細胞增殖，結果提示，經Ang-Ⅱ處理后心臟成纖維細胞增殖較Ctl組明顯加快(P<0.01)，48h后細胞增殖加快更加顯著，而加入黃連素后，低濃度黃連素處理的細胞增殖較單純Ang-Ⅱ組受到輕度抑制(P<0.05)，而高濃度的黃連素處理后較低濃度黃連素組抑制效果更明顯(P<0.05)，尤其是在經過48h藥物作用后，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4C。

圖4 黃連素抑制Ang-Ⅱ誘導的心臟成纖維細胞增殖Fig.4 Berberine inhibits angiotensin Ⅱ-induced cardiac fibroblast proliferationA： 心臟成纖維細胞免疫熒光鑒定，綠色為Vimentin抗原陽性；紅色為α-SMA抗原陽性，藍色為DAPI染色；B： 黃連素對心臟成纖維細胞毒性測定；C： 細胞增殖檢測，與Ang-Ⅱ組相比，*P<0.05，**P<0.01，與Ang-Ⅱ+Low BBR組相比，#P<0.05

2.6 黃連素抑制Ang-Ⅱ誘導成纖維細胞增殖于G0/G1期

心臟成纖維細胞經Ang-Ⅱ及黃連素處理后，于流式細胞儀檢測細胞增殖情況，計算S+G2期百分比。結果顯示，與Ctl組相比，Ang-Ⅱ處理后細胞增殖明顯加快(P<0.01)，黃連素處理可明顯抑制細胞增殖于G0/G1期(P<0.05)，高濃度黃連素較低濃度黃連素抑制增殖效果更明顯(P<0.05)，且與Ctl組相比差異無統計學意義，見圖5。

2.7 黃連素通過下調CDK2活性來抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心臟成纖維細胞增殖

Western印跡法顯示，Ang-Ⅱ可明顯提高細胞CDK2-T160磷酸化水平(P<0.01)及Cyclin D1表達(P<0.01)，高劑量黃連素處理后大鼠心肌細胞CDK2-T160磷酸化水平及Cyclin D1表達較Ang-Ⅱ組均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，與Ctl組相比差異無統計學意義；而低劑量黃連素處理后CDK2-T160磷酸化水平及Cyclin D1表達下降不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖6。

2.8 CDK2-T160D超表達后黃連素對心臟成纖維細胞增殖的抑制作用消失

CDK2-T160A是顯性陰性突變體，突變后T160不能被上游分子磷酸化，而CDK2-T160D是顯性陽性突變體，突變后其磷酸化被固化。CDK-T160A及CDK2-T160D病毒包裝、感染細胞，在Ang-Ⅱ及黃連素作用后，CCK8檢測提示，黃連素處理后Ade-CDK2-T160A感染的心臟成纖維細胞增殖變化不顯著，而CDK2-T160D超表達后明顯促進細胞增殖(P<0.01)，結合之前黃連素對Ang-Ⅱ誘導的野生型SD大鼠成纖維細胞增殖有抑制作用，說明CDK2-T160D超表達后黃連素對細胞增殖的抑制作用消失，見圖7A。而比較加或不加黃連素對于Ade-CDK2-T160A或Ade-CDK2-T160D感染細胞的區別，結果顯示低濃度或高濃度黃連素對細胞增殖的作用均不顯著，見圖7B。

圖5 黃連素抑制Ang-Ⅱ誘導的心臟成纖維 細胞增殖伴有CDK2活性下調Fig.5 Berberine inhibits angiotensin Ⅱ-induced fibroblast proliferation and inactivates CDK2A： 流式細胞術檢測各組細胞增殖；B： 各組S+G2期細胞百分比比較；*P<0.05，**P<0.01

2.9 CDK2-T160D超表達后顯著上調經黃連素處理后的心臟成纖維細胞CDK2活性

用黃連素處理病毒感染及Ang-Ⅱ 刺激的細胞后，Western印跡法顯示，黃連素對Ade-CDK2-T160A感染的心臟成纖維細胞CDK2-T160磷酸化作用不明顯，CDK2-T160D超表達后各組CDK2總蛋白量較CDK2-T160A各組變化不明顯，而CDK2-T160磷酸化水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)，結合之前黃連素可以抑制Ang-Ⅱ誘導的CDK2-T160磷酸化的結果，說明CDK2-T160D的超表達使得黃連素不能通過抑制CDK2-T160的磷酸化來下調CDK2的活性，見圖8。

圖6 黃連素下調CDK2活性Fig.6 Berberine inactivates CDK2A： Western印跡法檢測CDK2-T160蛋白磷酸化、CDK2總蛋白表達量及Cyclin D1蛋白表達量；B： 各組p-CDK2-T160、CDK2及Cyclin D，表達比較*P<0.05，**P<0.01

圖7 CDK2-T160D超表達后黃連素對心臟成 纖維細胞增殖的抑制作用消失Fig.7 Overexpression of CDK2-T160D in cardiac fibroblasts blocked the inhibitory effect of berberine on cell proliferationA： Ade-CDK2-T160A或Ade-CDK2-T160D感染后細胞增殖比較，*P<0.05，**P<0.01；B： 黃連素對Ade-CDK2-T160A或Ade-CDK2-T160D感染后細胞增殖的影響

圖8 黃連素通過下調CDK2活性實現對血管緊張素Ⅱ 誘導的心臟成纖維細胞增殖的抑制作用Fig.8 Berberine inhibits angiotensin Ⅱ-induced fibroblast proliferation through inactivation of CDK2A： Western印跡法檢測CDK2總蛋白表達量及CDK2-T160磷酸化水平；B： 各組p-CDK-T160與T-CDK2比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

心肌纖維化是由炎癥或其他損傷導致的纖維結締組織對心臟侵害的結果，是心肌重構的重要病理過程[1-2]。心肌細胞再生能力可以忽略不計，急性心肌梗死后，大量心肌細胞因為急性缺血死亡而觸發炎癥反應，最終導致膠原蛋白性瘢痕替代死亡的心肌[19-20]。在沒有完全梗死的情況下，其他的病理生理狀況也會誘發隱性間質和血管周膠原沉積，最終導致纖維化，比如高血壓或主動脈瓣狹窄引起的壓力超負荷以及瓣膜反流性病變引起的容量超負荷[1,21]。另外肥厚型心肌病、擴張型心肌病、代謝紊亂以及多種毒性損傷也常常表現為明顯的心肌纖維化[22]。心肌纖維化會增加左心室的僵硬度，阻礙心臟的收縮和舒張，導致心力衰竭，同時改變心電傳導引起心律失常[3-4]。因此抑制或逆轉心肌纖維化及其不良后果是目前臨床用于治療心臟病的干預措施的主要目標，對緩解心力衰竭、心律失常的發生是有益的，但是由于纖維化的病理機制復雜，目前針對心肌纖維化的治療方法匱乏且療效甚微。

Ang-Ⅱ及其受體在心肌纖維化病理進程中起重要作用，低劑量的Ang-Ⅱ已用于誘發心臟肥大和廣泛的心肌纖維化[22-23]。本研究在體內實驗顯示，中低劑量及高劑量黃連素灌胃處理大鼠后可顯著降低Ang-Ⅱ誘發的心肌纖維化程度，減輕其引發的大鼠心功能不全，并且小劑量黃連素治療即可取得顯著治療效果。體外實驗顯示，黃連素可顯著抑制Ang-Ⅱ誘導的成纖維細胞增殖，這與以前的實驗結果相符。在體內及體外實驗中，小劑量黃連素即可表現出顯著抑制Ang-Ⅱ誘導的心肌纖維化的作用，心肌纖維化程度及成纖維細胞增殖均明顯受到抑制，而高劑量黃連素這種抑制效果更明顯，表明黃連素抑制心肌纖維化的作用呈濃度依賴性，并且是一種比較安全的抑制心肌纖維化的藥物。

既往的研究[24-25]表明，心臟成纖維細胞過度分化和增殖在心肌纖維化過程中的作用至關重要。流式細胞術檢測顯示，Ang-Ⅱ可促進心臟成纖維細胞由G0/G1向S及G2轉變加速細胞增殖，而經黃連素處理后，可明顯抑制細胞向S期轉化，下調DNA合成，從而起到抑制增殖的作用。細胞增殖周期通過高度受控的過程調節細胞增殖，該過程涉及復雜的細胞事件級聯反應，包括Cyclin和細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)，CDK2/Cyclin D1復合體是細胞周期從G0/G1到S期轉變的重要因子[16,26]。Western印跡法檢測結果提示，黃連素在體內及體外均明顯抑制了Ang-Ⅱ誘導的CDK2-T160磷酸化，并抑制Cyclin D1的表達。體外用CDK2-T160A及CDK2-T160D腺病毒感染心臟成纖維細胞后，用Ang-Ⅱ及黃連素處理細胞，結果顯示低濃度及高濃度黃連素對Ade-CDK2-T160A組細胞的增殖抑制作用不顯著，Western印跡法檢測提示黃連素對Ade-CDK2-T160A組細胞的CDK2-T160磷酸化水平影響也不顯著。而隨著CDK2-T160D被超表達，黃連素對細胞增殖的抑制作用消失，細胞增殖明顯加快，Western印跡法檢測提示CDK2-T160D超表達后細胞內CDK2表達量較CDK2-T160A組變化不明顯，而CDK2-T160磷酸化水平明顯增加，提示CDK2-T160D超表達使黃連素喪失對CDK2活性的下調作用。因此，本研究認為黃連素通過下調CDK2活性來抑制Ang-Ⅱ 誘導的成纖維細胞增殖達到抑制心肌纖維化的作用，其作用位點為T160。

當前的研究存在的局限性在于，體內實驗僅研究了Ang-Ⅱ及黃連素對心臟成纖維細胞的作用，沒有研究黃連素對其他細胞的影響，因此需要進一步的研究以闡明黃連素對其他細胞影響的特定機制。

綜上所述，黃連素通過抑制CDK2-T160磷酸化下調CDK2活性來顯著抑制心臟成纖維細胞的增殖及心肌纖維化。心肌纖維化及成纖維細胞的增殖可能與CDK2-T160磷酸化位點有關，因此CDK2-T160可能是防治心肌纖維化新的靶點。