前前腦-丘腦環路在全腦缺血期間低溫誘導的腦保護中的作用

王小華，聶彬彬，李燕虹，趙 菁，張 婷，王天龍，姜 偉

心臟驟停(CA)具有極高的死亡率及嚴重腦功能障礙后遺癥，并給公眾健康帶來了巨大的負擔。在1985年-2018年期間，院內心臟驟停(IHCA)后的1 y生存率較差，為13.4%。院外心臟驟停是世界范圍內死亡的主要原因，生存率為13%，并且大多數幸存者患有永久性缺氧性腦損傷[1～3]。

近年來的研究證明，對CA后的造成的全腦缺血(GI)，低溫具有腦保護作用[4,5]，92%的患者在接受低溫治療后恢復到正常或接近正常的神經功能水平[6]。臨床結果提供了強有力的證據，1例大型隨機對照試驗得出結論，心肺復蘇后，32 ℃～34 ℃低溫減少恢復期腦功能障礙[7]。鑒于低溫在GI中的重要性，以往的研究已經在相關的RNA、蛋白質和細胞因子水平研究了其潛在的腦保護機制[8]。在GI條件下,低溫也保護神經元線粒體和神經血管單位[19]。3項利用核磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)大型試驗表明，低溫降低了腦損傷的頻率和嚴重程度[10～12]。然而，到目前為止，低溫在腦網絡的功能和代謝活動中的保護機制尚不清楚。

在本研究中，我們使用18F-氟脫氧葡萄糖正電子發射斷層掃描(18F-FDG-PET)定量測定低溫及常溫全腦缺血后，低溫對不同腦區和節點的葡萄糖代謝的保護作用。此外，我們還利用擴散張量成像(diffusion tense image,DTI)造影重建受低溫保護的腦白質連接網絡。

1 材料和方法

1.1 動物模型 研究方案得到首都醫科大學動物倫理委員會的批準，按照法律和道德的動物護理國際準則，18只Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(北京維塔爾河實驗動物技術有限公司，許可證編號:SCXS2001-0017)，9～11 w齡，體重320～350 g，隨機分為3組。低溫GI組：(6只大鼠)建立GI模型的同時體溫維持在31 ℃～33 ℃。具體：將溫度探頭插入直腸，將大鼠放置在冷卻/溫熱毯上，將其連接到恒溫控制系統，通過反饋調節來保持溫度，在25 min的降溫期間，用酒精噴灑在大鼠的皮毛上，以降低體溫，低溫期維持期150 min，后大鼠復溫30 min，再保持正常溫度直至掃描。常溫GI組：(6只大鼠)采用相同系統的冷卻/溫毯建立GI模型，體溫始終維持在37 ℃～37.5 ℃，持續時間約為150 min。假手術組：(6只大鼠)維持在37 ℃～37.5 ℃，頸部正中切口，但不誘導GI模型(見圖1)。

圖1 記錄低溫全腦缺血(GI)組和常溫全腦缺血GI組的直腸溫度，反映全腦缺血模型過程中的體溫穩定性

通過Longa技術行雙血管閉塞(2VO)構建GI模型[13～15]。頸外靜脈插入導管抽血，左股動脈進行血壓監測，右股動脈進行藥物輸注。頸部正中切口，雙側頸總動脈(CCA)被分離并與下方放置結扎線。肝素(150 IU/kg)靜脈注射，通過頸靜脈導管抽血，維持40～50 mmHg的平均動脈壓(mean blood pressure)MBP。在手術過程中，注意保留迷走神經，測量血氣，調整插管期間呼吸器的潮氣量，以達到動脈血氧分壓(PaO2)>90 mmHg，動脈二氧化碳分壓(PaCO2)為35～45 mmHg，pH為7.35～7.45。結扎左側CCA 10 min后，結扎右側CCA，最終阻斷腦血流。共15 min后，緩慢通過頸靜脈導管回灌血液，注入0.5 ml碳酸氫鈉(0.6 M)。在135 min的恢復期后，傷口被縫合，大鼠被送回籠子。

1.218F-FDG-PET和DTIMRI數據采集 建立GI模型后24 h對大鼠進行掃描。在18F-FDG注射前，所有大鼠都禁食12 h～15 h，但在任何時候都可以獲得飲用水。18F-FDG是從atom-hitech(HTA)技術有限公司(中國北京)(www.atom-hitech.com)獲得的。每只大鼠18F-FDG(體重18.5 MBq/100 g)經尾靜脈注射，后大鼠被關在籠子里，并被放置在一個環境噪聲最小的房間中40 min，以攝取18F-FDG。腦內18F-FDG攝取最大化的攝取周期為40 min。隨后，大鼠在掃描過程中使用鼻吸入異氟醚麻醉(100%氧氣中2% IsoFlo)(河北久木制藥有限公司，中國)，并將塑料立體定向頭架放置在掃描儀床上的俯臥位置上。在動物PET系統(中國科學院高能物理研究所，E-plus260)上獲得18F-FDG-PET圖像，其徑向空間分辨率為1.55 mm全寬半最大值(FWHM)，位于視野中心(FOV)。在FDG-PET掃描過程中，大鼠大腦以FOV為中心進行靜態采集10 min。然后利用有序子集期望最大化(4次迭代，12次子集)算法對圖像進行重構。在90×97×200矩陣上重建它們，體素大小為0.5×0.5和1 mm3。最后，所有掃描都以分析格式保存。使用7.0T動物MRI掃描儀(70/16掃描，BrukerBiospinGmbH，德國)獲得DTI數據，使用38毫米大鼠腦正交諧振器進行射頻傳輸和接收。用回波平面成像序列[重復時間(TR)=12000 ms、回波時間(TE)=32.248 ms、矩陣大小163獲得DTI圖像=128×128×48，體素大小=0.35×0.35，0.56 mm，無片間隙]。沿30個獨立軸施加擴散加權，b值為1000 s/mm2。獲得了5幅b值為0 s/mm2的參考圖像。最后，所有原始的Bruker圖像都被轉換為DICOM格式，軟件程序(Paravision 5.0)內置在掃描儀。

1.318F-FDG-PET圖像分析 所有18F-FDG-PET圖像的數據分析在SPM8(Wellcome，認知神經學系，倫敦，英國)的SpmratIHEP工具箱中進行。首先，使用MRIcro手動移除所有圖像的身體組織和背景，并在D3V重新定位圖像的來源，這與Paxinos & Watson空間中的標準18F-FDG-PET模板相對應。然后，將單個大鼠腦圖像空間歸一化為Paxinos和Watson空間，將分析頭中的體素大小放大4倍，注冊到18F-FDG-PET模板，通過顱內圖像去除顱外組織，剪切矩陣以切去背景。最后，將所有歸一化的18F-FDG-PET圖像用高斯核2×2×4 mm3FWHM平滑。進一步體素統計分析，所有平滑的數據都是基于一般線性模型(GLM)框架的體素分析。為了確定18F-FDG信號的顯著性差異，使用SPM8進行了檢測。采用基于無偏尺度因子的比例縮放和強度歸一化來解釋混雜因素。最后，根據體素水平的高度閾值P值<0.005，得到了具有顯著18F-FDG變化的腦區。錯誤發現率(FDR)校正在多個比較在集群級別進行。通過基于體素的分析對數據進行分析,每個束的內部輪廓的調整也根據矢狀面和橫截面進行解釋(大鼠大腦圖譜的立體定向坐標，x軸對中線左側為負，對右側為正;y軸對腹方向相對于背側方向為正;z軸對嗅球相對前囟為正，對小腦方向為負)。當低溫GI組或常溫GI組與假手術組比較時，如果18F-FDG攝取低于假手術組，并提示低代謝區(則顯示冷色藍色);如果18F-FDG攝取高于或等于假手術組，則提示高代謝區(顯示為暖色，橘紅及紅色);如果18F-FDG攝取等于假手術組，則提示等代謝區(顯示為灰色)。KE值表示集群的大小，即表示低體積區的體積。

1.4 MRIDTI圖像分析 所有DTI圖像在FSL(FMRIB軟件庫)(http://fmrib.ox.ac.uk/fsl)中進行預處理。簡單地說，使用FMRIB的擴散工具箱在FSL中去除頭動和渦流。然后計算每個單束的分數各向異性(Flip angle)(FA)和平均擴散率(Mean diffusion)(MD)。隨后，在SpmratI HEP工具箱(SPM8)中對FA和MD圖像進行體素分析。簡單地說，通過顱骨剝離和重新定位原點，對FA和MD數據集進行了預處理。然后，將FA圖像空間歸一化為Paxinos & Watson空間中的FA模板圖像，并與MD圖像一起歸一化并進行平滑。最后，基于GLM框架對所有平滑數據進行體素分析，基于體素水平的高度閾值(P<0.005)對腦區進行顯著FDG變化比較，并通過多重比較進行FDR校正。

1.5 統計學分析 在SmraIHEP中進行統計分析如下：平均低溫GI組和常溫GI組的值，與假手術組進行比較。顯著性水平定期設定為P<0.05。基于廣義線性模型。建立平滑平均歸一化攝取值18F-FDG-PET數據的統計分析模型，通過低溫GI組和常溫組建立兩個樣本t檢驗分析。在KE中計算(Mn-UV)，對于聚類中的體素數，它直接反映了區域的體積。Tmax值是每個集群中的最大t值，Tmax值>1表示差異顯著。峰值坐標(mm)是Paxinos & Watson空間中最大點的坐標。

2 結 果

2.1 PET掃描分析結果顯示，低溫全腦缺血組和常溫全腦缺血組，腦中低代謝區域的差異 在PET掃描中的偽彩色方格顯示了低溫/常溫GI組與假手術組相比，在顯著不同的區域的FDG攝取變化顯示(見圖2A、B)中。低代謝區域(藍色區域)反應受損傷區域，與低溫GI組相比，常溫GI組的大鼠腦中低代謝區域明顯范圍更大(見圖2A、B)。

圖2 與低溫全腦缺血組相比，常溫全腦缺血組的低代謝區明顯增大。冷偽色(藍色)表示相對于假手術組的低代謝區域，而暖偽色(橘色)則表示相對于假手術組的高代謝區域。(A)常溫全腦缺血組冠狀切面；(B)低溫全腦缺血組的冠狀切面

我們進一步分析了低溫保護區域的分布情況，我們發現低溫全腦缺血組，前腦和丘腦的相對保存完好。此外，低溫全腦缺血組GI組丘腦區低代謝區較常溫全腦缺血組GI組明顯縮小(見圖3A、B)。與常溫GI組相比，低溫GI組在前前腦皮質(PFC)和丘腦(Ts)也有的低代謝區明顯較小(見圖3A、B)。這些結果提示，全腦缺血條件下低溫有選擇性的保護前前腦(皮質)和丘腦(皮質下部分)。

圖3 低溫GI組丘腦(Ts)區低代謝區(藍色區域)較常溫GI組明顯消失。前前腦皮質(PFC)和感覺皮質(SC)的低代謝區(藍色區域)在低溫GI組也明顯較小。冷偽色(藍色區域)表示相對于假手術組同腦區的低代謝區域，而暖偽色(紅色區域)則表示相對于假手術組高代謝區域。(A)常溫GI組的冠狀切面;(B)低溫GI組的冠狀切面;(C)常溫GI組的矢狀面;(D)低溫GI組的矢狀面。前前腦皮質：PFC；Ts丘腦；SC感覺皮質

同時，體素分析的精確數據結果顯示(見表1)，統計結果的定量信息列于表1，其中“KE”表示每個簇中的體素數，即KE數代表具有顯著低代謝的特定區域的體積。Tmax表示每個集群中的最大t值。Ts丘腦區是前前腦丘腦中間環路的中心，在低溫GI組與常溫GI組相比明顯縮小。常溫GI組丘腦區(Ts區)KE=2391(Tmax=6.1129)，低溫GI組KE=342(Tmax=5.8853)(見表1)。PFC是前前腦-丘腦環路中一個非常重要的區域，低溫GI組與常溫GI組相比，PFC區的低代謝區域(藍色區域)也明顯縮小。常溫GI組PFC區KE值=553(Tmax=4.2414)。在低溫GI組中，KE值=71(Tmax=6.8144)(見表1)。在低溫GI組中，前前腦環路關鍵性節點結構的保存，這表明與低溫參與此區域的細胞的保護。

表1 在低溫全球缺血組和常溫全球缺血組中，簇大小代表簇內體素數的KE值。兩組之間的兩個樣本t檢驗的統計結果

2.2 MRI T2結果分析顯示與低溫全腦缺血組相比，常溫全腦缺血損傷丘腦區損傷明顯 從MRI T2可以看出，在低溫全腦缺血組中幾乎觀察不到直接的腦損傷表現，而常溫全腦缺血組損傷明顯。而損傷區域的差異，集中在丘腦區域。

2.3 DTI結果分析顯示，低溫全腦缺血與常溫全腦缺血白質纖維結連上的差異 從DTI結果來看，所有白質纖維都在皮質下和皮質結構之間進行了跟蹤(見表2)。白質纖維中的各向異性(FA)值高提示白質纖維的保存完好。前前腦-丘腦環路的主要連接白色纖維是內囊(IC)和胼胝體(CC)，它們FA在低溫GI組較高，與常溫GI組比較，FA-IC(分別為0.458±0.058和0.710±0.159)；FA-CC(分別為0.384、0.01和0.408±0.051；P<0.01和P<0.05)。FMI、MLF和SM也是前腦丘腦中間回路的結締組織纖維。胼胝體(FMI)[(0.928±0.071)vs(0.696±0.121)；P<0.05]、內側縱束(MLF)[(0.894±0.050)vs 2560.661，0.131；P<0.05]和丘腦中紋(SM)[0.405，0.209，(0.225±0.064)；P<0.05]。在低溫的保護下，前前腦-丘腦環路白質纖維的功能/結構損傷明顯降低(見表2)。

表2 基于FA值的中間電路中白質束的詳細信息

圖4 常溫全腦缺血組與低溫全腦缺血組，在MRI T2圖像上的腦損傷差異。常溫全腦缺血組丘腦區有明顯的損傷。(A)常溫全腦缺血組;(B)低溫全腦缺血組

3 討 論

我們的研究發現低溫GI組與常溫GI組相比，前前腦-丘腦環路神經元代謝活性和連接組織纖維明顯保留。理論上，全腦缺血應當在所有腦區產生相對均勻的細胞損傷，然而，我們發現低溫在特殊的神經元群體和不同的腦區對缺血產生分級和差異性保護。本研究發現低溫GI組低代謝區相對較低。在低溫GI組中，前前腦神經元代謝活性得到了顯著的保留，如18F-FDG-PET發現所示。低溫可選擇性地保留丘腦和PFC的代謝激活。此外，MRI結果也支持了這一觀察，在DTI中，FA還顯示了CC和IC的保存，這是前前腦-丘腦環路纖維連接。在我們的研究中，PFC、丘腦和相關連接被低溫顯著保存，被確定為前腦丘腦中間回路的關鍵成分[16]。前前腦-丘腦環路被選擇性地保留，表明該環路在低溫保護中起著關鍵作用。前前腦-丘腦環路是維持正常意識、喚醒和睡眠覺醒的核心環路[17]。此環路在從具有潛在保留意識的昏迷中恢復中起著關鍵作用，也為中樞丘腦作為喚醒神經調節的特殊節點提供了概念基礎[18]。

總之，低溫選擇性地保護了整個大腦中的特殊連接節點和功能和代謝大腦活動中的相關網絡。在GI期間，整個大腦的血液供應明顯減少，然而，在低溫治療后，前前腦-丘腦環路的關鍵部位被保留下來。基于18F-FDG-PET和DTI-MRI的發現，我們證明了在GI過程中低溫保存前前腦-丘腦環路。前前腦-丘腦環路可能發展成為全腦缺血患者治療的有力和潛在靶點，為嚴重癱瘓患者提供福音和希望。

4 致 謝

PET在中國科學院高能物理研究所北京放射技術與設備工程研究中心進行。作者感謝彭程對PET分析的幫助。作者還感謝薛景泉和楊文江進行PET掃描。